豬圓環病毒地方株的分離與測定

胡元春　河南省新鄉市動物疫病預防控制中心　453000

豬圓環病毒地方株的分離與測定

胡元春河南省新鄉市動物疫病預防控制中心453000

豬圓環病毒病 （PCVD）是由豬圓環病毒2型（PCV2）引起的豬傳染性疾病，該病的主要特征為患豬體質下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發育不良、腹瀉、呼吸困難和母豬繁殖障礙。豬圓環病毒是目前發現的一種最小的哺乳動物病毒，包括兩個血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2有致病性。

現有6份臨床癥狀疑似PCVD的病毒料，需要分離病毒，建立PCR及ELISA方法進行檢測。

1　材料與方法

（1）試驗材料。試驗病料來自不同地區疑似被PCV2感染豬的肺、淋巴結和肝等器官的組織病料。試驗試劑及主要儀器有胰酶、D-hanks液PCR擴增儀、低溫高速離心機、臺式離心機、電泳儀和凝膠成像系統。

（2）試驗方法。細胞培養于37℃、5%CO2的環境中。細胞生長液為含8%血清的DMEM培養液，維持液為含4%的DMEM培養液。2天傳代1次。將病料組織剪碎，用Hanks液研磨并制成5～10倍乳懸液反復凍融，離心 0.22μm微孔過濾后-20℃保存。當細胞長滿50%～70%左右，將處理好的病毒上清液滴入細胞瓶內，在37℃、5%CO2培養半小時，倒掉病毒液，然后加入4%DMEM維持液。當細胞長滿單層后，細胞傳代方法操作換8%DMEM維持液，盲傳3代，未出現細胞病變。含有病毒液的細胞瓶存放于-20℃冰柜中，凍融3次后，收取病毒液密封凍存于-20℃備用。從病毒液上清中提取DNA，加入PCR反應體系中。體系為25μl。上游引物P1：5’-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’；下游引物P2：5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’；片段751bp。94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘，循環35次。72℃最后延伸10分鐘。

本實驗按照參考文獻的方法介紹，處理待測樣品。用酶標儀在450nm處測OD值。

2　結果與分析

樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到750bp左右的特異性核苷酸片段，與實驗預期結果一致。實驗病毒料的OD值與陰性樣本的OD值之比為2∶7，實驗結果為陽性，與實驗預期結果一致。

3　討論

仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（PMWS）和多種疫病都與PCV2相關聯。現在主要應用PCR等分子生物學方法診斷PCV2，因此對不同地區來源的PCV2毒株基因組序列確定其基因序列變異程度，可以為建立有效的PCV研究方法提供依據。

PCV2單獨感染時的癥狀和病變并無特征性，必須借助實驗室手段才能進行確診。目前研究較多的實驗室檢測技術有間接免疫熒光（IFA）、間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）、單克隆抗體以及多種聚合酶鏈式反應（PCR）技術等。與傳統方法相比，PCR具有較高的敏感性和特異性，而且操作簡便，是最常見的診斷方法。本實驗的檢測結果為陽性，初步鑒定該病毒為豬圓環病毒。但有關該病毒料的其他一些生物學特性尚待進一步鑒定。