銀杏果淀粉酶解條件研究

楊冬梅 王 艷 張學(xué)兵 胡佳琪

(杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江 杭州310023)

銀杏果淀粉酶解條件研究

楊冬梅 王 艷 張學(xué)兵 胡佳琪

(杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江 杭州310023)

為了研究銀杏果實(shí)中淀粉水解的條件，分別采用液化酶和糖化酶對銀杏果實(shí)中的淀粉進(jìn)行酶解試驗(yàn)，考察不同工藝條件（如溫度、時(shí)間、用量）對液化酶、糖化酶酶解銀杏淀粉效果影響。結(jié)果表明：液化酶最佳酶解工藝條件：液化溫度60℃、液化時(shí)間30min、液化酶添加量0.03%；糖化酶最佳酶解工藝條件：糖化溫度60℃、糖化時(shí)間90min、銀杏漿液糖化酶添加量0.01%，最后的酶解率可達(dá)到74%。該課題的研究為銀杏飲料的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

銀杏果；淀粉；酶解

銀杏(Ginkgobiloba L.)系侏羅紀(jì)的孑遺植物，素有裸子植物的“活化石”之稱，為世界珍貴的藥食兼用的植物資源[1]。銀杏果，又名白果，內(nèi)含多種生物活性營養(yǎng)物質(zhì)，每100g干果中含蛋白質(zhì)13.4g、脂肪3g、碳水化合物71.2g、鈣19.6mg、胡蘿卜素0.2mg、硫胺素0.44mg、尼克酸2.6mg，另外還含有少量的赤霉素和細(xì)胞分裂素等[2]。雖然銀杏果在中國的食用歷史已有1000余年歷史，但一直以來，銀杏果吃法僅限于制作成家庭菜肴，未有進(jìn)行深加工開發(fā)，且這種家庭做法往往不能保證將其中的微量氫氰酸破壞，偶爾會(huì)造成中毒現(xiàn)象的發(fā)生[3]。近年來，銀杏果的深加工已經(jīng)被重視起來，銀杏果酒、銀杏葉飲料、銀杏果脯等發(fā)面的研究，但是將銀杏果制作成飲料的研究并不多見。這是因?yàn)殂y杏果實(shí)富含淀粉,淀粉經(jīng)加熱后大多以糊化的狀態(tài)存在,糊化的淀粉易老化而產(chǎn)生混濁或分層沉淀,而且不易過濾,制成飲料后穩(wěn)定性差。因此，如何解決銀杏果實(shí)中淀粉等大分子物質(zhì)的溶解性問題，將是關(guān)系到飲料品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

本試驗(yàn)采用液化酶、糖化酶酶解銀杏果淀粉，使其中的淀粉含量減少，可溶解的成分增加。淀粉酶解產(chǎn)生的糊精和糖類都有良好的溶解性，還原糖在固體飲料中往往充當(dāng)著分散劑的作用，對于改善產(chǎn)品的沖調(diào)性也有明顯作用，這樣銀杏果飲料的穩(wěn)定性就大大的提高了。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏果：市售，購買后放冰箱中冷藏；

阿拉丁α-中溫淀粉酶（4645.76μml）、

阿拉丁糖化酶（99600μml）、可溶性淀粉、碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、糊精、淀粉、冰醋酸、醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、DNS試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-S21-4-S(新苗)恒溫水浴鍋、pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)、TGL-16G臺式離心機(jī)、TM-768打漿機(jī)、772型可見分光光度計(jì)、分析天平、電爐。

1.3 銀杏漿液制備

新鮮銀杏果→預(yù)煮20分鐘→去殼去皮去芯→打漿（料水比1: 6）→放冰箱儲(chǔ)存。

本實(shí)驗(yàn)銀杏漿液打漿時(shí)，采用巴氏殺菌后的冷水打漿并盡量在48小時(shí)內(nèi)使用完。打漿后的銀杏漿液較為粘稠，顏色呈乳白色略帶淺黃色。計(jì)量方式采用稱重。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

本次實(shí)驗(yàn)首先采用可溶性淀粉為反應(yīng)底物，測得其酶活性為實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)依據(jù)并對其用量進(jìn)行粗略的預(yù)測。再以銀杏進(jìn)行酶解條件研究。

1.4.1 α-淀粉酶活力測定[5]

α-淀粉酶能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘呈藍(lán)紫色的特異性反應(yīng)逐漸消失。其顏色消失的速度與酶活力有關(guān)。故可以通過固定反應(yīng)的時(shí)間計(jì)算其酶活力。

取2mL標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液與標(biāo)準(zhǔn)稀碘液）于白瓷板空穴內(nèi)，作為比較終點(diǎn)顏色的標(biāo)準(zhǔn)。取5.5%可溶性淀粉20mL和pH6.0磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液5mL裝入大試管中，在60℃恒溫水浴中預(yù)熱4～5min.然后加入預(yù)先稀釋好的α-淀粉酶酶液0.5mL，立即記錄時(shí)間，充分搖勻，定時(shí)用吸管取出反應(yīng)液0.5mL，滴于預(yù)先充滿稀碘液(約1.5mE)的白瓷板空穴內(nèi)，當(dāng)穴內(nèi)顏色由藍(lán)紫色漸變?yōu)樽丶t色，與標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色相同時(shí)，即為反應(yīng)終點(diǎn)，并記錄時(shí)間。

根據(jù)以下公式計(jì)算：X=60／t×20×5.5%×n／0.5

式中：

X為酶活力單位，u／g

n為稀釋倍數(shù)

t為測定記錄時(shí)間。min；

60為分鐘數(shù)

20為可溶性淀粉的毫升數(shù)

5.5%為淀粉濃度

0.5為測定時(shí)稀酶液用量。

1.4.2 糖化酶活力測定

糖化型淀粉酶(即淀粉-1，4-葡萄糖苷酶，簡稱糖化酶)能將淀粉從分子鏈非還原性末端開始，分解a-1，4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。糖化酶的活力：用1g固體酶粉（或1ml液體酶），于40℃、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，為1個(gè)酶活力單位，以u/g（u/ml）表示[6]。故可以通過一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖計(jì)算其酶活力。

吸取液體酶1.00ml移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（估計(jì)酶活力在100～250u/ml范圍內(nèi)），搖勻。測定于甲、乙兩支50ml比色管中，分別加入可溶性淀粉25ml及緩沖液5ml，搖勻后，于40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）中加入待測酶液2ml，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立刻各加入氫氧化鈉溶液0.2ml，搖勻，將兩管取出迅速冷卻，定容到250ml，取1ml使用DNS法測得其葡萄糖含量。（見2.2.4）

X=A×1/2×n×2

式中：

X——樣品的酶活力（u/g或u/ml）

A——葡萄糖的量（mg）

1/2——吸取酶液2ml，換算為1ml

n——稀釋倍數(shù)

2——反應(yīng)30min，換算成1h的酶活力系數(shù)所得的結(jié)果表示至整數(shù)

1.4.3 銀杏漿液酶解

準(zhǔn)確稱取銀杏漿液40g于小燒杯中，蒙上保鮮膜，沸水浴滅菌5分鐘，冷卻，預(yù)熱。準(zhǔn)備已經(jīng)用緩沖液稀釋好的α-淀粉酶酶液，在恒溫水浴鍋中，預(yù)熱5分鐘后，加入小燒杯中。完成酶解后，沸水浴滅菌5分鐘，冷卻，加入稀HCl將酶液調(diào)節(jié)至4.25左右，預(yù)熱。準(zhǔn)備已經(jīng)用緩沖液稀釋好的糖化酶酶液，在恒溫水浴鍋中，預(yù)熱5分鐘后，加入小燒杯中。完成酶解后，沸水浴滅菌5分鐘，冷卻。

1.4.4 DNS法測定總糖和還原糖[7]

1）樣品中含糖量（OD值）的測定

樣品葡萄糖的含量檢測：

將酶解好的銀杏漿液定容的100ml，取一部分進(jìn)行離心后，取上層清液10ml定容到100ml，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍，用于還原糖的測定。

樣品總糖的水解及提取：

準(zhǔn)確稱取15g銀杏漿液，放在小燒杯中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如果已經(jīng)水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解完成后，冷卻至室溫加入1滴酚酞指示劑，以NaOH稀溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍，用于總糖測定。測定后，取樣品的光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。

2）結(jié)果處理

按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：

y=2.3319x-0.054

x——λ=540nm處測定吸光度A

y——葡萄糖濃度

3）DE值計(jì)算

DE=銀杏漿液中還原糖含量/銀杏漿液中總糖含量×100%

2 結(jié)果與討論

銀杏果。又名白果，內(nèi)含多種生物活性營養(yǎng)物質(zhì)，每100g干果中含蛋白質(zhì) 13.49g、脂肪 3g、碳水化合物 71.2g、鈣 19.6mg、胡蘿卜素0.2mg、硫胺素0.44mg、尼克酸2.6mg，另外還含有少量的赤霉素和細(xì)胞分裂素等，另外含有17種氨基酸、白果醇（10-廿九烷醇）、白果酮、廿八醇、B-谷甾醇、豆甾醇、生物堿等[8]。銀杏種仁中淀粉占了種子成分干重的很大一部分，這種組分也是導(dǎo)致銀杏果飲料不穩(wěn)定的主要因素，因此，選用酶將它降解成適當(dāng)相對分子質(zhì)量的物質(zhì)，以提高它們的溶解性。

2.1 α-中溫淀粉酶條件篩選

淀粉酶分為內(nèi)切酶、外切酶、糖化酶等，本實(shí)驗(yàn)選用的α一淀粉酶是一類內(nèi)切酶，它從分子內(nèi)部任意切開α-1，4葡萄糖苷鍵，生成大分子糊精和低聚糖，達(dá)到使淀粉液化的目的[10]。

DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。 糖化液中還原性糖全部當(dāng)作葡萄糖計(jì)算，占總糖的百分比即為DE值。因此，需要計(jì)算出銀杏果中的總糖含量。

實(shí)驗(yàn)采用酸水解[9]的方法將銀杏果中的糖類全部水解后，采用DNS法測出其中的糖含量，測得1:6的銀杏漿液中含總糖的量為2.151mg/ml。

2.1.1 α-中溫淀粉酶用量

雖然對于α-中溫淀粉酶的活性做了大概的預(yù)測，但是運(yùn)用在銀杏淀粉上會(huì)有一些差異，因此，需要對其進(jìn)行多次試驗(yàn)，先從大范圍到小范圍進(jìn)行篩選，最后得到最適宜的用量。實(shí)驗(yàn)中為了避免銀杏漿液中本來就存在的還原糖或其他的原因會(huì)引起實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)還設(shè)計(jì)了空白實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中的空白對照，對照組中在未加入α-中溫淀粉酶酶液。以便更好的了解各種介質(zhì)條件對于酶解的影響。

實(shí)驗(yàn)中共分為5個(gè)樣品，α-中溫淀粉酶酶液用量為0.8ml、1.0ml、1.3ml、1.6ml，酶解溫度為60℃，酶解時(shí)間為60min，糖化酶酶解溫度為60℃，用量為0.4ml，酶解時(shí)間為60min。DE值是溶液中還原糖占總糖含量的比值，當(dāng)溶液中DE值增大時(shí)，表明其中的一部分不可溶解的淀粉或者糊精等酶解成了可溶解的還原糖，這樣使用DNS法就能通過檢測出的DE值，得出銀杏漿液中淀粉是否被酶解以及被酶解的程度，篩選出更為適宜的酶解條件。（見表1）

表1 α-中溫淀粉酶的用量對銀杏淀粉酶解的影響Tab.1 Effect of middle-temperature α-amylase dosage on ginkgo starch

實(shí)驗(yàn)證明，酶液的用量對于酶解程度有很大的影響，溶液中DE值隨著α-中溫淀粉酶使用量增大而增大，當(dāng)α-中溫淀粉酶使用量達(dá)到1.3ml以后，DE值就不再增加了。說明淀粉分子能被α-中溫淀粉酶切斷的已經(jīng)全部被切斷。因此，選擇α-中溫淀粉酶酶液的使用量為1.3ml進(jìn)行酶解。

2.1.2 α-中溫淀粉酶溫度

通過一些資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)，將溫度設(shè)計(jì)為50℃、60℃、70℃、80℃，酶液用量為1.3ml，酶解時(shí)間為60min，糖化酶酶解溫度為60℃，用量為0.4ml，酶解時(shí)間為60min。對比酶解后的DE值得到的最佳的酶解溫度。酶解時(shí)，溫度的控制采用溫度計(jì)。由于溫度相差較小時(shí)，差別不大，因此，選用10℃的間隔。

實(shí)驗(yàn)證明，溫度對于酶解的程度影響較大，當(dāng)溫度過高或過低時(shí)，都會(huì)影響酶解的效果。當(dāng)溫度達(dá)到70℃以上時(shí)，酶的活性大部分都被抑制，DE值只達(dá)到了46.9%，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，銀杏淀粉被酶解程度最高DE值為69.1%，因此，選擇α-中溫淀粉酶酶液的酶解溫度為60℃進(jìn)行酶解。

表2 α-中溫淀粉酶的酶解溫度對銀杏淀粉酶解的影響Tab.2 Effect of middle-temperature α-amylase enzymolysis temperature on ginkgo starch

2.1.3 α-中溫淀粉酶酶解時(shí)間

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)預(yù)測酶解時(shí)間20min-60min左右達(dá)到最佳，故將酶解時(shí)間設(shè)計(jì)為20min、30min、40min、50min，酶液用量為1.3ml，酶解溫度為60℃，糖化酶酶解溫度為60℃，用量為0.4ml，酶解時(shí)間為60min。對比酶解后的DE值得到最佳的酶解時(shí)間。

由表3中可知，酶解20min后溶液中的還原糖含量達(dá)到總糖含量的48%，酶解30min后溶液中的還原糖含量達(dá)到總糖含量的55.3%，相比較未加入α-中溫淀粉酶的空白試驗(yàn)提高了19%。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到30min以上時(shí)，DE值不再增加。因此，α-中溫淀粉酶酶液酶解最佳時(shí)間設(shè)為30min。

表3 α-中溫淀粉酶的酶解時(shí)間對銀杏淀粉酶解的影響Tab.3 Effect of middle-temperature α-amylase enzymolysis time on ginkgo starch

2.2 糖化酶條件篩選

α-中溫淀粉酶只能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，單一使用α-中溫淀粉酶酶解效率較低，而糖化酶能將淀粉從分子鏈非還原性末端開始，分解a一1，4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。因此,采用糖化酶配合酶解。

2.2.1 糖化酶用量

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)預(yù)測，糖化酶酶液酶解時(shí)用量為0.8ml、1.0ml、1.3ml、1.6ml，酶解溫度為60℃，酶解時(shí)間為60min，α-中溫淀粉酶酶解溫度為60℃，用量為1.3ml，酶解時(shí)間為30min。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的空白實(shí)驗(yàn)，對照組中在未加入糖化酶酶液。可利用空白中的值來反映酶解試驗(yàn)是否有效，以及糖化酶在整個(gè)酶解過程中作出的貢獻(xiàn)占比。酶解時(shí)，采用稀HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至4.25左右，并每隔5分鐘進(jìn)行搖晃，根據(jù)最后的DE值,篩選出更為適宜的酶解條件。

由表4中可見，酶液的用量對于酶解程度有很大的影響，溶液中DE值隨著糖化酶使用量增大而增大，當(dāng)糖化酶使用量達(dá)到0.8ml以后，DE值就幾乎不再增加了。0.8ml用量糖化酶酶解后銀杏漿液的DE值為67.7%，相比較α-中溫淀粉酶酶解DE值有了比較明顯的增加，1.0ml用量糖化酶酶解后銀杏漿液的DE值為67.8%，0.8ml用量的效率比較高，因此，選擇糖化酶酶液的使用量為0.8ml進(jìn)行酶解。

表4 糖化酶的用量對銀杏淀粉酶解的影響Tab.4 Effect of saccharifying enzyme dosage on ginkgo starch

2.2.2 糖化酶酶解時(shí)間

通過資料查找的預(yù)測酶解時(shí)間30-120min時(shí)左右達(dá)到最佳，故將酶解時(shí)間設(shè)計(jì)為30min、60min、90min、120min，酶液用量為0.8ml，酶解溫度為60℃，α-中溫淀粉酶酶解溫度為60℃，用量為1.3ml，酶解時(shí)間為30min。對比酶解后的DE值得到最佳的酶解時(shí)間。

由表5中可知，酶解90min后溶液中的還原糖含量達(dá)到總糖含量的74.6%，相比較未加入糖化酶的空白試驗(yàn)提高了54.5%。酶解120min后溶液中的還原糖含量達(dá)到總糖含量的74.5%，未有增加，因此，α-中溫淀粉酶酶液酶解最佳時(shí)間設(shè)為90min。

表5 糖化酶的酶解時(shí)間對銀杏淀粉酶解的影響Tab.5 Effect of saccharifying enzyme α-amylase enzymolysis time on ginkgo starch

2.2.3 糖化酶酶解溫度

通過一些資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)，將溫度設(shè)計(jì)為50℃、60℃、70℃、80℃，酶液用量為 0.8ml，酶解時(shí)間為 90min，α-中溫淀粉酶酶解溫度為60℃，用量為1.3ml，酶解時(shí)間為60min。對比酶解后的DE值得到的最佳的酶解溫度。酶解時(shí)，溫度的控制采用溫度計(jì)。由于溫度相差較小時(shí)，差別不大，因此，選用10℃的間隔。

實(shí)驗(yàn)證明，溫度對于酶解的程度影響較大，當(dāng)溫度過高或過低時(shí)，都會(huì)影響酶解的效果。當(dāng)溫度達(dá)到80℃以上時(shí)，酶的活性被抑制，DE值只達(dá)到了53.0%，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，銀杏淀粉被酶解程度最高DE值為73.8%，因此，選擇糖化酶酶液的酶解溫度為60℃進(jìn)行酶解。（見表6）

表6 糖化酶的酶解溫度對銀杏淀粉酶解的影響Tab.6 Effect of saccharifying enzyme α-amylase enzymolysis temperature on ginkgo starch

3 結(jié)論

經(jīng)過α-中溫淀粉酶和糖化酶的酶解后，銀杏漿液中的可溶性物質(zhì)增加，沉淀物降低，穩(wěn)定性提高，銀杏漿液相較于未酶解時(shí)澄清，香味更濃郁。酶解DE值提高至70%以上。

通過單因素實(shí)驗(yàn)，已確定雙酶法酶解銀杏淀粉的條件。液化酶最佳的工藝條件:液化溫度60℃、液化時(shí)間30min、銀杏漿液液化酶添加量0.03%。糖化酶最佳的工藝條件：糖化溫度60℃、糖化時(shí)間90min、銀杏漿液糖化酶添加量0.01%，酶解率能達(dá)到74%（DE值）。

［1］宋永芳.銀杏的化學(xué)成分和用途[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),1986（3）:91-94.

［2］梁立興．中國當(dāng)代銀杏大全[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993．

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［12］敖自華,王璋,許時(shí)嬰.銀杏淀粉特性的研究[J].食品科學(xué),1999(10):35-39.

［責(zé)任編輯：田吉捷］

Hydrolysis Conditions of Enzyme on Starch in Gingko

YANG Dong-mei WANG Yan ZHANG Xue-bing HU Jia-qi
(Wan Xiang polytechnic,Hangzhou Zhejiang 310023,China)

In order to explore the conditions of enzymolysis of starch in gingko,liquifying enzyme and saccharifying enzyme were used to catalyze amylolysis respectively,and the proper temperature,time and dosage were studied.Results showed that the optimum conditions were:for liquifying enzyme,60℃,30min,0.03%;and for saccharifying enzyme,60℃,90min and 0.01%.

Gingko;Starch;Enzymolysis

2014年度杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級課題資助，浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201328349）。

楊冬梅（1978.08—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。