乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆的構建及在Huh7細胞中的表達*

趙建華,陸仁飛

(江蘇省南通市第三人民醫院檢驗科 226006)

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·論 著·

乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆的構建及在Huh7細胞中的表達*

趙建華,陸仁飛△

(江蘇省南通市第三人民醫院檢驗科 226006)

目的 利用重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)快速構建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆，觀察重組質粒在Huh7細胞中的表達，建立HBV阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)的體外研究細胞模型。方法 設計保守引物，從慢性乙型肝炎阿德福韋酯耐藥患者血清中擴增全長HBV基因組，利用SOE-PCR技術構建1.3倍基因組長度的感染性克隆質粒pHBV1.3，轉染肝癌細胞系Huh7，采Western Blot、Real-time PCR檢測感染性克隆復制以及表達情況，同時用抗病毒藥物拉米夫定以及阿德福韋酯驗證對感染性克隆復制及表達的抑制情況。結果 成功構建了HBV阿德福韋酯耐藥株感染性克隆質粒pHBV1.3(RT A181T),該質粒在Huh7細胞系中能有效復制、轉錄和表達。拉米夫定能有效抑制該感染性克隆的復制和表達，阿德福韋酯不能抑制該感染性克隆的復制和表達。結論 構建的HBV阿德福韋酯耐藥株感染性克隆質粒pHBV1.3(RT A181T)在體外能高效復制及表達蛋白，其轉染細胞可用于HBV復制機制及抗病毒研究。

乙型肝炎病毒； 阿德福韋酯； 耐藥； 感染性克隆

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全世界廣泛流行，據文獻報道全球約有20億人感染過HBV，每年大約有100萬人死于因HBV感染而繼發的慢性乙型肝炎、肝硬化和原發性肝癌，嚴重影響了人類的健康[1-3]。開展HBV研究的困難之一就是缺乏很好的體內感染動物模型及體外感染細胞模型。目前，體外感染的細胞模型主要以穩定表達HBV的HepG2.2.15細胞系為主[4]。該HBV的病毒基因型為D型、血清型為ayw的野生型[5]。近年來，拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋及替比夫定等核苷(類)抗病毒藥物已經廣泛應用于慢性乙型肝炎的臨床治療。隨著大范圍、長時間的抗病毒藥物治療，HBV耐藥問題已經成為臨床慢性乙型肝炎治療的棘手問題[6]。相應的，構建各種耐藥株的感染性克隆用于HBV復制機制以及抗病毒研究已顯得十分迫切與必要。大量研究證實，HBV的1.1、1.2、1.3倍體重組質粒均能在人類的肝癌細胞系中完成核酸的復制及相關蛋白的表達，其中1.3倍體HBV核酸復制水平和蛋白表達水平是最高的[7-8]。本研究從慢性乙型肝炎阿德福韋酯耐藥患者血清中擴增全長HBV基因組，利用重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)技術快速構建1.3倍HBV的感染性克隆質粒pHBV1.3(RT A181T)，在體外驗證了該感染性克隆的核酸復制、蛋白表達以及抗病毒藥物耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞株Huh7用含10%胎牛血清(Gibco公司)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基、37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。細胞株購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 HBV阿德福韋酯耐藥株基因組DNA的提取 HBV血清標本均來源于南通大學附屬第三醫院檢驗科，患者均長期服用阿德福韋酯，并出現病毒學突破被診斷為阿德福韋酯臨床耐藥，標本中HBV的DNA載量在104～107copy/mL。磁分離試劑盒(北京鑫諾美迪公司)抽提HBV DNA，提取方法嚴格參照說明書，提取的HBV DNA在-20 ℃保存備用。

1.2.2 HBV全長基因組的克隆 參考文獻[9]的引物設計，F1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3′；R1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3′。以上述方法提取的HBV DNA為模板,采用高保真性聚合酶KOD plus(Toyobo公司)進行PCR擴增，DNA膠回收試劑盒(上海生工生物有限公司)瓊脂糖凝膠電泳膠回收PCR產物，用平末端克隆載體試劑盒pEASY-Blunt Zero cloning kit(北京全式金公司)連接目的片段和載體，然后轉化感受態細胞TOP10(Tiangen公司)，涂板過夜培養，挑取單菌落，酶切鑒定，陽性菌落送上海邁浦生物公司測序。測序結果采用MEGA5軟件BLAST分析。

1.2.3 利用SOE-PCR構建1.3倍體HBV 利用SOE-PCR技術構建HBV的感染性克隆-1.3倍體HBV(阿德福韋酯耐藥，RT A181T)，命名為pHBV1.3(RT A181T)，測序驗證。

1.2.4 感染性克隆Huh7細胞的轉染及表達 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)脂質體轉染肝癌細胞系Huh7，轉染方法參照說明書。共轉染3種質粒，實驗組為質粒pHBV1.3(RT A181T)，轉染空載體pBluescript KS(+)(陰性對照)和pHBV1.3(C)質粒(陽性對照)。轉染后6 h換液，48 h后分別吸取培養上清液和收集細胞，通過免疫印跡實驗檢測蛋白表達水平，Real-time PCR檢測復制水平。

1.2.5 免疫印跡試驗 裂解轉染后的Huh7細胞,上樣，SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉膜，轉膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。一抗使用濃度如下：鼠抗-HBs單克隆抗體1∶1 000稀釋，兔抗-HBc單克隆抗體1∶4 000稀釋，兔抗-GAPDH單克隆抗體1∶1 000稀釋，抗體均購自Santa Cruz公司。孵育結束后洗膜，加二抗室溫孵育1 h，二抗使用濃度如下：HRP標記的羊抗-鼠IgG 1∶5 000稀釋，HRP標記的驢抗-兔IgG 1∶5 000稀釋，二抗均購自Sigma公司。孵育結束后洗膜。用化學發光顯色試劑盒Immobilon Western(Millipore公司)暗室顯影。

1.2.6 Real-time PCR試驗 采用HBV實時熒光定量試劑盒(上海科華生物工程有限公司)檢測轉染后分泌到培養基上清液中的HBV DNA載量，具體操作步驟以及擴增條件按照產品說明書進行，PCR儀(ABI7500)。

1.2.7 藥物敏感試驗 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉染Huh7肝癌細胞系12 h后，換成含不同濃度拉米夫定(0、0.5、1、2 μg/mL)的培養基和不同濃度阿德福韋酯(0、0.5、1、2 μg/mL)培養基，繼續培養36 h，分別收集上清液和細胞，檢測核酸復制水平和蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 HBV 阿德福韋酯耐藥株基因組的克隆 收集7份HBV 阿德福韋酯耐藥患者血清，提取HBV DNA。以提取的HBV DNA為模板，采用高保真性聚合酶進行擴增。PCR擴增后與載體連接，轉化大腸桿菌TOP10并涂板，挑取單克隆酶切鑒定，結果顯示：在載體中插入了一個大小約3 200 bp的DNA片段，陽性克隆送測序。測序結果BLAST分析顯示，克隆到的這株HBV，基因組的C、X、P和S區4個ORF區均完整無致死性突變，但在反轉錄區181位置出現了A→T的突變，表明克隆的這株HBV發生了阿德福韋酯的基因型耐藥，將克隆到的這株阿德福韋酯耐藥的HBV全長基因組命名為pHBV(RT A181T)。

以克隆到的pHBV(RT A181T)為模板進行亞克隆，通過SOE-PCR構建1.3倍體HBV感染性克隆，將構建的亞克隆1.3倍體HBV重組質粒以及空載體pBluescript KS(+)進行酶切鑒定，1.3倍體HBV重組質粒單酶切后呈線性片段，約7 000 bp，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后可見3 000 bp位置和接近4 300 bp位置有兩條明顯的條帶，即載體pBluescript KS(+)和目的片段HBV1.3，證實1.3倍體HBV重組質粒構建成功,命名為pHBV1.3(RT A181T)。

2.2 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)的體外復制

2.2.1 轉染細胞表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg) 為了驗證感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)能否在Huh7細胞中表達HBsAg、HBcAg，本研究進行了轉染實驗。感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉染Huh7細胞48 h后，分別收集轉染pHBV1.3(RT A181T)Huh7細胞培養上清液以及轉染細胞，同時以未轉染質粒的Huh7細胞為陰性對照，轉染pHBV1.3(C)的Huh7細胞為陽性對照。免疫印跡實驗結果顯示：和陽性對照一樣，轉染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細胞的均明顯表達蛋白HBsAg、HBeAg，而陰性對照無相應蛋白表達。

2.2.2 轉染細胞分泌HBV DNA 為檢測轉染細胞是否分泌HBV顆粒，利用熒光探針PCR法檢測培養上清液中HBV DNA的載量，結果顯示：和陽性對照一樣，轉染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細胞上清液中HBV DNA的滴度達到106copy/mL，而陰性對未檢測到HBV DNA。

2.3 抗病毒藥物敏感性檢測 為檢測轉染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細胞對藥物的敏感性，將抗病毒治療藥物拉米夫定、阿德福韋酯加入到pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細胞中。在加入拉米夫定后，HBV感染性克隆表達的蛋白HBsAg、HBeAg明顯受到抑制，且與藥物劑量正相關。而加入阿德福韋酯后，HBV感染性克隆表達的蛋白HBsAg、HBeAg不受抑制。實驗表明，所構建的感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉染Huh7后，對拉米夫定敏感，對阿德福韋酯耐藥。

3 討 論

此前的報道中，構建HBV感染性克隆采用的方法一般都是以擴增的HBV 基因組短片段基礎上，通過幾次酶切連接，拼接成HBV感染性克隆[10-11]。這種方法耗時耗力，還受到酶切效率及酶切特異性的限制，很難精準構建合適起止位點的1.3倍體HBV感染性克隆。SOE-PCR技術采用具有互補末端的引物,使模板鏈之間形成了重疊區域,從而在隨后的延伸過程中沿著重疊部分延伸,將兩條具有部分重疊區域的模板鏈拼接起來[12-13]。該技術能夠對目的基因進行快速、方便的片段重組,并且不需要內切酶和連接酶處理,利用該技術也能快速地將兩條短片段合成一條長片段[14]。通過精巧的引物設計，在線性HBV全基因組序列前面增加了一組內源性的HBV增強子和啟動子，由此構建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆轉染Huh7細胞后，將依賴自身啟動子啟動轉錄翻譯，這樣可以充分反映HBV病毒株的自身轉錄情況，有利于研究 HBV 復制和轉錄翻譯的全過程。

在本研究中，從HBV 阿德福韋酯耐藥患者血清中擴增得到1株完整的HBV基因組，經局部系列比對基本檢索工具分析顯示，該株病毒基因組的C、X、P和S區4個ORF區均完整無致死性突變，并且在反轉錄區181位置出現了A→T的突變，表明發生了抗病毒藥物阿德福韋酯基因型耐藥。以克隆到的HBV全基因組為模板，通過SOE-PCR快速構建了1.3倍體HBV感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)。pHBV1.3(RT A181T)是完整的病毒復制體，包含了5′末端增強子EnhⅠ、EnhⅡ、復制起始位點(DR1和DR2)、前基因組轉錄起始位點、X開放讀碼框等，可轉錄產生3.5、2.4、2.1、0.8 Kb等所有HBV轉錄產物[15-16]。

最后，將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆轉染Huh7細胞系。通過免疫印跡實驗和real-time PCR等方法，驗證了感染性克隆核酸復制及特異性蛋白合成的能力，結果顯示構建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆具備完整的核酸復制及蛋白合成能力。而且，該感染性克隆對抗病毒藥物拉米夫定敏感，對抗病毒藥物阿德福韋酯耐藥。因此，構建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆可用于HBV基礎研究及臨床抗病毒藥物耐藥研究。

本研究將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆瞬時轉染Huh7細胞株，HBV在細胞內的復制以及相關蛋白的表達在轉染48 h后達到峰值，隨著時間的推移病毒的復制以及相關蛋白的表達都逐漸下降，因此將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆穩定轉染Huh7細胞株,構建穩定表達的細胞株將是下階段實驗的重點，為進一步研究HBV的結構和功能、表達與調控、病毒與宿主的關系、抗病毒藥物的篩選提供研究工具。

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Construction of infectious clone of HBV adefovir-resistant strain RT A181T and its expression in Huh7 cells*

ZHAOJianhua,LURenfei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NantongMunicipalThirdPeople′sHospital,Nantong,Jiangsu226006,China)

Objective To rapidly construct hepatitis B virus(HBV) adefovir(ADV)-resistant strain(RT A181T) infectious clone by using SOE-PCR,to observe the expression of recombinant plasmids in Huh7 cells and to establish the in vitro cell model of HBV ADV-resistant strain(RT A181T).Methods The conservative primers were designed,the full-length HBV genome was amplified from serum in the patients with ADV-resistant chronic hepatitis B.Then,the 1.3-fold genome-length infectious clone pHBV1.3 was constructed by using the SOE-PCR technique,which was transfected into human hepatoma cells Huh7 cell line.ELISA,Western Blot and Real-time PCR were adopted to detect infectious cloning replication and expression,meanwhile the antiviral drugs lamivudine(LAM) and ADV were used to verify the infectious clone copy and inhibition of expression.Results The HBV ADV-resistant infectious cloning plasmids pHBV1.3 was successfully constructed.This plasmid could be effectively replicated,transcripted and expressed in Huh7 cell lines.LAM could effectively inhibit the replication and expression of the infectious clone,while ADV could not inhibit the replication and expression of the infectious clone.Conclusion The constructed infectious clone plasmids pHBV1.3(RT A181T) of HBV ADV-resistant strain can efficiently replicate and express protein in vitro,its transfected cells can be used in the study of HBV replication mechanism and antiviral study.

hepatitis B virus; adefovir; drug resistance; infectious clone

江蘇省南通市衛生和計劃生育委員會資助項目(WQ2014038，W201217)；江蘇省南通市科技局資助項目(HS2014062)。

趙建華，男，副主任技師，主要從事臨床微生物研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.010

A

1673-4130(2016)23-3266-03

2016-06-02

2016-07-22)