噬菌體治療細菌性感染的研究進展*

高 靜 綜述，劉 新 審校

(沈陽醫(yī)學院病原生物學教研室，沈陽 110034)

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噬菌體治療細菌性感染的研究進展*

高 靜 綜述，劉 新△審校

(沈陽醫(yī)學院病原生物學教研室，沈陽 110034)

噬菌體； 細菌性感染； 多重耐藥菌

1915年，F(xiàn)rederick在研究牛痘病毒時，發(fā)現(xiàn)細菌被殺死的現(xiàn)象，但尚未進行深入研究[1]。1917年，F(xiàn)elix發(fā)現(xiàn)了一種能夠殺滅涂布在瓊脂表面上細菌并且呈現(xiàn)獨立噬斑的“微生物”，并認為這種微生物可以侵入細菌內(nèi)并在其體內(nèi)擴增，因此稱之為“噬菌體”。此后，噬菌體的研究拉開了帷幕。噬菌體被定義為一類能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。1921年，Bruynogh和Maisin首次利用噬菌體治療了由葡萄球菌引起的人類皮膚癤腫。在噬菌體研究的前十年里，研究者們因過多關注噬菌體的應用而忽視了噬菌體的生物學特性。起初，研究者們在噬菌體中只檢測到蛋白質(zhì)，直到1936年，Schlesinger研究發(fā)現(xiàn)噬菌體中還存在DNA，這才證實了噬菌體是由核酸和蛋白質(zhì)組成的病毒顆粒。1940年，Ruska 首次用電鏡觀察到噬菌體的形態(tài)。隨后，陸續(xù)有研究者利用電鏡觀察到噬菌體的形態(tài)并得出了噬菌體的一般特征。噬菌體的生物學特性逐漸明了。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，出現(xiàn)了越來越多的難以用抗菌藥物治療的多重耐藥菌(MDR)，現(xiàn)已成為全球許多重癥監(jiān)護室(ICU)一個迫在眉睫的醫(yī)療危機[2]。人們不得不將關注點轉向尋找抗菌藥物的替代療法。于是，噬菌體療法成為了一個潛在的治療細菌感染的可行性方案。

1 噬菌體的類型及其生物學特性

噬菌體根據(jù)生活方式分為毒性噬菌體和溫和噬菌體[3]。毒性噬菌體又稱裂解性噬菌體，能夠在敏感菌中增殖并引起細菌裂解；溫和噬菌體又稱為溶原性噬菌體，感染細菌后，將其基因整合于細菌染色體中，不引起宿主菌裂解，隨宿主菌的繁殖將基因傳到子代。

當噬菌體寄生在細菌細胞內(nèi)時，可呈現(xiàn)出不同的生活狀態(tài)。無論噬菌體處于何種生活狀態(tài)，在進入細菌前，第一步都是先與細菌細胞壁上的受體結合。這個特定的過程會影響噬菌體與細菌的相互作用。例如，噬菌體λ僅與大腸桿菌的LamB受體相互作用，并且此作用對于噬菌體成功侵入細菌非常重要，即噬菌體具有特異性，僅選擇特異性受體才能侵入細菌[4]。

研究表明，某些噬菌體在與特異性受體作用之前，能合成水解酶或多糖分解酶系及多糖裂解酶，這些酶可以降解宿主菌的多糖，為噬菌體治療提供了潛在的意義，但目前尚在研究中，還未應用于臨床[5]。

噬菌體在與特定的受體結合后，通過細菌的細胞壁打開缺口，然后把噬菌體DNA注入細菌的細胞內(nèi)，其蛋白質(zhì)外殼留在菌體外。如果是溫和噬菌體，噬菌體DNA插入到細菌的染色體上，成為細菌染色體的一部分，隨細菌繁殖而傳代。因此，溫和噬菌體不產(chǎn)生子代噬菌體，但這種噬菌體DNA隨著細菌DNA的復制進行復制，直到誘發(fā)裂解周期。當溫和噬菌體因發(fā)生變異而失去進入裂解周期的能力，噬菌體DNA會成為細菌染色體的一部分，成為一個長期寄住于宿主染色體的噬菌體序列，即前噬菌體。如果是毒性噬菌體，感染宿主菌后馬上進行噬菌體早期基因的表達，噬菌體利用細菌的細胞器復制子代噬菌體的核酸和蛋白質(zhì)，然后組裝、釋放新合成的子代噬菌體。

噬菌體可通過轉導作用傳遞細菌之間的遺傳物質(zhì)，因此，可以利用生物工程技術將抗菌藥物敏感基因表達于目的菌中，通過轉導作用轉移抗菌藥物敏感基因。例如，Lu等[6]的研究表明，在體外通過M13mp18噬菌體靶向SOS DNA修復系統(tǒng)插入特定基因，增加了大腸桿菌對抗菌藥物的敏感性。Edgar等[7]利用轉基因技術將特定的基因轉入耐藥菌內(nèi)，增加耐藥菌對鏈霉素和萘啶酸的敏感性。

2 噬菌體治療的潛在優(yōu)勢

毒性噬菌體是天然的抗菌藥物，能夠裂解細菌，可作用于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，包括耐藥菌。噬菌體具有嚴格的宿主專一性，不會破壞正常菌群，同時噬菌體的治療效果不因細菌耐藥性而改變[8]。

2.1 噬菌體治療的療效 噬菌體具有的高度的特異性和嚴格的宿主專一性，使噬菌體能夠有效控制細菌性感染。徐花等[9]在小鼠經(jīng)腹腔感染最小致死量(MLD)的黏質(zhì)沙雷菌后，立即給予的噬菌體治療能顯著提高小鼠的存活率。Kumari等[10]用肺炎克雷伯菌B5055建立全層燒傷創(chuàng)面感染的小鼠模型，分別應用硝酸銀、慶大霉素和肺炎克雷伯菌噬菌體Kpn5治療，結果表明，單劑量的噬菌體Kpn5治療顯著降低了小鼠病死率，并且治療效果優(yōu)于硝酸銀和慶大霉素治療。

然而，由于噬菌體的高度特異性，使噬菌體具有較窄的宿主譜，限制了噬菌體治療。隨著研究的進展，國內(nèi)外的一些研究人員利用多種噬菌體混合制劑(噬菌體雞尾酒)治療細菌感染，從而達到擴寬宿主譜、提高治療效果的目的。例如，劉曉賀等[11]應用噬菌體GH15和噬菌體K聯(lián)合治療由金黃色葡萄球菌感染引發(fā)的菌血癥小鼠，結果表明，噬菌體GH15和K聯(lián)合使用的治療效果優(yōu)于單一噬菌體治療。Tamariz等[12]通過皮下和靜脈接種的方式建立由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的局部和全身性感染的小鼠模型，然后，選用噬菌體雞尾酒法治療，結果表明，噬菌體雞尾酒法治療能有效控制局部的MRSA感染。

2.2 噬菌體治療細菌性炎癥 孫利利等[13]用金黃色葡萄球菌噬菌體對患有急性乳腺炎的奶牛進行治療，結果表明，奶牛病灶內(nèi)的細菌數(shù)量顯著下降，經(jīng)過治療，奶牛的炎癥得以治愈并恢復了正常的產(chǎn)奶能力。Miedzybrodzki等[14]對患有人工關節(jié)感染、皮膚和軟組織感染或下呼吸道感染的患者進行噬菌體治療，他們的C-反應蛋白(CRP)和白細胞計數(shù)最初沒有受到影響，而在第9～32天卻顯著減少。但研究中也發(fā)現(xiàn)，CRP初始水平高于10 mg/dL的患者的CRP才會受到影響[15]。

2.3 噬菌體治療的醫(yī)療成本 Miedzybrodzki等[16]選擇了6例被葡萄球菌感染患者作為研究對象，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌感染和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染，結果表明，噬菌體治療的治療費用明顯低于抗菌藥物治療。這說明，噬菌體治療可以節(jié)省醫(yī)療費用。

2.4 噬菌體治療的安全性 Rhoads等[17]進行了一項隨機對照試驗，用噬菌體雞尾酒治療了42例因下肢慢性靜脈潰瘍而導致的由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌引起的3種不同的細菌感染患者，并評價了噬菌體療法的安全性，未發(fā)現(xiàn)有關噬菌體治療的不良反應。Abedon等[18]用單一的噬菌體噴霧處理大面積的燒傷部分，而遠處的傷口作為對照組，結果沒有出現(xiàn)安全問題。國內(nèi)也有一些針對噬菌體的安全性的研究。張紅梅等[19]向小鼠體內(nèi)注射噬菌體D29，發(fā)現(xiàn)噬菌體D29未對機體的安全產(chǎn)生威脅。靳靜等[20]也通過實驗證實了克雷伯菌屬噬菌體LH-01對小鼠具有良好的安全性。

以上研究尚未報告革蘭陰性菌噬菌體裂解宿主菌所產(chǎn)生的負面影響。雖然，小劑量的由革蘭陰性菌裂解釋放的內(nèi)毒素(LPS)作為特異性免疫刺激劑應用時，可增強機體非特異性抵抗力，也有增強抗感染免疫和抗腫瘤免疫作用[21]，但一般情況下，因革蘭陰性菌裂解產(chǎn)生的LPS的危害確實存在。由于目前缺乏大型的隨機對照試驗，因此還很難評估噬菌體治療的不良反應和潛在的影響。

鑒于噬菌體治療的優(yōu)勢，人們將噬菌體治療視為后抗菌藥物時代治療細菌性感染的一種療法。現(xiàn)在已有研究者們利用噬菌體治療傷寒、痢疾、沙門氏菌引起的相關腸炎、腹膜炎、皮膚感染、外科感染(主要是各部位膿腫)、敗血癥、尿路感染及耳鼻咽喉感染。

3 噬菌體治療的局限性

雖然噬菌體治療有許多優(yōu)點，但噬菌體應用于臨床治療仍需進一步確定。噬菌體治療之所以沒有廣泛應用于臨床治療，是因為此療法治療細菌感染有一定的局限性。

噬菌體治療的主要缺點是要先快速鑒定病原微生物。通過標準的微生物學鑒定程序，對臨床樣本進行鑒定；然后，分離特定的噬菌體；最后，利用噬菌體對患者進行抗菌治療。采用基因組方法和質(zhì)譜可能有助于新的細菌快速診斷方法。但目前，在大多數(shù)臨床微生物學實驗室和資源有限的基層醫(yī)療機構，還無法普及噬菌體治療。

噬菌體所具有的高度的特異性，使得噬菌體有一個狹窄的噬菌譜，僅限作用于單一物種或某個物種的單一菌株。溫和噬菌體不能引起細菌裂解，因此，噬菌體治療必須選擇毒性噬菌體。但毒性噬菌體在某些特定條件下可轉變?yōu)闇睾褪删w，這也是噬菌體治療所面臨的問題之一[22]。

在應用噬菌體治療細菌感染時，宿主菌可能會對噬菌體產(chǎn)生抗性。細菌對噬菌體的抵抗機制可分為4類：(1)吸附抑制。細菌通過自身基因的突變，使受體發(fā)生一些變化，如受體缺失、掩藏受體和受體突變，來阻止噬菌體吸附；或者通過產(chǎn)生莢膜、黏液層等阻止噬菌體接近而逃避噬菌體。(2)流產(chǎn)感染。噬菌體將其DNA注入宿主菌內(nèi)，噬菌體的復制受到阻斷，沒有子代噬菌體的產(chǎn)生和釋放。(3)穿入阻滯。依靠細菌外膜上的錨定蛋白或膜蛋白來阻止噬菌體DNA的注入，編碼這些蛋白的基因常會在前噬菌體中發(fā)現(xiàn)，細菌一旦具有了這些前噬菌體，就可抵抗同種噬菌體再次感染。(4)降解或干擾噬菌體DNA。限制-修飾系統(tǒng)可以保護細菌自身的DNA，識別細菌內(nèi)的外源DNA，并對其切割、降解。此外，細菌中的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(CRISPR)也可抵抗噬菌體[23-24]。同時，噬菌體的轉導作用和性菌毛的接合作用可能會在細菌之間發(fā)生基因轉移，導致產(chǎn)生一種新的微生物甚至更多的耐藥菌[25-26]。

毒性噬菌體導致細菌裂解，細菌釋放出的各種物質(zhì)如革蘭陰性菌的LPS，可導致嚴重的不良反應。LPS進入血循環(huán)后，機體出現(xiàn)LPS血癥，可使體溫上升、血液白細胞數(shù)驟減，嚴重時可引起LPS休克；嚴重者可活化凝血系統(tǒng)，出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC),引起皮膚和黏膜出血、滲血及內(nèi)臟廣泛出血，甚至死亡。因此，限制了噬菌體對革蘭陰性菌的治療。

噬菌體屬于病毒，在應用于治療人類感染時，可能被患者的免疫系統(tǒng)視為一個潛在的入侵者，特別是噬菌體外殼的蛋白，會成為抗原刺激免疫系統(tǒng)的反應，這使噬菌體進入體內(nèi)后可能會迅速被脾臟、肝臟和其他器官的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，或被免疫細胞清除[27]。

4 展 望

隨著抗菌藥物耐藥性問題的日益嚴重，尋找抗菌藥物替代品治療細菌感染變得尤為重要。雖然在近百年前就有人進行了噬菌體治療細菌感染的相關研究，如今人們又將視線聚焦于噬菌體的研究上，期待噬菌體自身的優(yōu)勢可以解決抗菌藥物治療所遇到的問題。盡管噬菌體治療細菌性感染有效，但仍有難題亟待解決，例如，如何保持噬菌體的穩(wěn)定性，如何準確把握給藥時間、給藥劑量和給藥途徑，以及如何提高給藥的效率及安全性等[28]。對于噬菌體的不足，人們也試圖尋找解決的方法，如篩選裂解性強的噬菌體[29]；尋找具有寬噬菌譜的噬菌體[30]；通過基因工程尋找合適的轉基因噬菌體[31]；應用噬菌體雞尾酒療法有效治療細菌感染等。隨著各種技術和方法的不斷改進，相信噬菌體治療的不利因素會逐漸被克服。

[1]沃爾德，弗里德曼，阿迪亞.噬菌體——在細菌致病機理及生物技術中的作用[M].北京：科學出版社，2007：3-9.

[2]Pendleton JN,Gorman SP,Gilmore BF.Clinical relevance of the ESKAPE pathogens[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2013,11(3):297-308.

[3]肖純凌，趙富璽.病原生物學和免疫學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：40-41.

[4]Chatterjee S,Rothenberg E.Interaction of bacteriophage l with its E.coli receptor,LamB[J].Viruses,2012,4(11):3162-3178.

[5]Drulis-Kawa Z,Majkowska-Skrobek G,Maciejewska B,et al.Learning from bacteriophages-advantages and limitations of phage and phage-encoded protein applications[J].Curr Protein Pept Sci,2012,13(8):699-722.

[6]Lu TK,Collins JJ.Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,6(12):4629-4634.

[7]Edgar R,Friedman N,Molshanski-Mor S,et al.Reversing bacterial resistance to antibiotics by phage-mediated delivery of dominant sensitive genes[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(3):744-751.

[8]郭曉奎.后抗菌藥物時代我們?nèi)绾握鞣毦鶾J].上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2012，32(11)：1401-1403.

[9]徐花，李毅，逯茵茵，等.噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌感染BALB/c小鼠的保護作用[J].微生物與感染，2015，10(2)：103-107.

[10]Kumari S,Harjai K,Chhibber S.Bacteriophage versus antimicrobial agents for the treatment of murine burn wound infection caused by klebsiella pneumoniae B5055[J].J Med Microbiol,2011,60(2):205-210.

[11]劉曉賀，顧敬敏，韓文瑜，等.應用噬菌體GH15和K治療金黃色葡萄球菌感染[J].微生物學報，2013，53(5)：498-506.

[12]Tamariz JH,Lezameta L,Guerra H.Phagotherapy faced with staphylococcus aureus methicilin resistant infections in mice[J].Rev Peru Med Exp Salud Publica,2014,31(1):69-77.

[13]孫利利，楊毓，童貽剛，等.金黃色葡萄球菌噬菌體對奶牛乳腺炎的治療效果[J].沈陽大學學報(自然科學版)，2015，27(1)：7-11.

[14]Miedzybrodzki R,Fortuna W,Weber-Dabrowska B,et al.A retrospective analysis of changes in inflammatory markers in patients treated with bacterial viruses[J].Clin Exp Med,2009,9(4):303-312.

[15]Miedzybrodzki R,Borysowski J,Weber-Dabrowska B,et al.Clinical aspects of phage therapy[J].Adv Virus Res,2012,83(1):73-121.

[16]Miedzybrodzki R,Fortuna W,Weber-Dabrowska B,et al.Phage therapy of staphylococcal infections(including MRSA) may be less expensive than antibiotic treatment[J].Postepy Hig Med Dosw,2007,61(5):461-465.

[17]Rhoads DD,Wolcott RD,Kuskowski MA,et al.Bacteriophage therapy of venous leg ulcers in humans:results of a phase I safety trial[J].J Wound Care,2009,18(6):237-242.

[18]Abedon ST,Kuhl SJ,Blasdel BG,et al.Phage treatment of human infections[J].Bacteriophage,2011,1(2):66-85.

[19]張紅梅，梁梅，劉平，等.噬菌體D29的免疫原性及安全性評價[J].世界科技研究與發(fā)展，2012，34(4)：692-695.

[20]靳靜，陳松建，張改，等.克雷伯菌屬噬菌體LH-01的生物學特性及其對敗血癥小鼠療效的初步研究[J].中國病原生物學雜志，2015，10(1)：25-28.

[21]張鳳民，肖純凌.醫(yī)學微生物學[M].3版.北京：北京大學醫(yī)學出版社，2013：71-72.

[22]吳填順，郭通，劉新.噬菌體治療鮑曼不動桿菌感染的綜述[J].沈陽醫(yī)學院學報，2014，16(4)：243-244.

[23]徐嘉良，闞飆.細菌的噬菌體感染抗性機制[J].生物技術通訊，2013，24(3)：409-413.

[24]黃建軍.細菌對噬菌體感染的抵抗[J].免疫學雜志，2002，18(3)：135-138.

[25]Maiques E,Ubeda C,Tormo MA,et al.Role of staphylococcal phage and SaPI integrase in intra- and interspecies SaPI transfer[J].J Bacteriol,2007,189(15):5608-5616.

[26]周園，王嵐，林鴻，等.鮑曼不動桿菌耐藥性與噬菌體的相關性[J].中國老年學雜志，2016，36(3)：709-711.

[27]Dabrowska K,Switata-Jelen K,Opolski A,et al.Bacteriophage penetration in vertebrates[J].J Appl Microbiol,2005,98(1):7-13.

[28]Pouillot F,Chomton M,Blois H,et al.Efficacy of bacteriophage therapy in experimental sepsis and meningitis caused by a clone O25b:H 4-ST131 escherichia coli strain producing CTX-M-15[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(7):3568-3575.

[29]路榮，顧敬敏，劉曉賀，等.NDM-1肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其對小鼠菌血癥的治療研究[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32(12)：1747-1751.

[30]代芳芳，趙秀英，于艷華，等.醫(yī)院內(nèi)寬嗜性銅綠假單胞菌噬菌體的分離篩選[J].首都醫(yī)科大學學報，2013，34(5)：727-732.

[31]韓晗，李劍峰，姜金仲，等.噬菌體治療的另一種策略--轉基因噬菌體[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47(6)：138-141.

遼寧省科學事業(yè)公益研究基金項目(GY2013-A-014)；沈陽醫(yī)學院重點實驗室研究基金項目(20135060)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.033

A

1673-4130(2016)23-3325-03

2016-05-29

2016-08-19)

△通訊作者，E-mail:syliuxin141236@sina.cn。