水牛精液冷凍稀釋液研究現狀

付　平，張力青，郭妮妮，易四鳳，全凡凡（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢430070）

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水牛精液冷凍稀釋液研究現狀

付平，張力青，郭妮妮，易四鳳，全凡凡
（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢430070）

摘要：牛的精液冷凍保存技術已較成熟，其商品化的精液冷凍稀釋液也很多，而水牛的精液稀釋液大多還是沿用奶牛和黃牛的，但是近年來關于水牛精液冷凍稀釋液的研究也逐漸開展。文章對最新水牛的精液冷凍稀釋液成分的研究現狀進行了綜述，期望在實際生產中對水牛精液的冷凍保存提供一些參考。

關鍵詞：水牛；精液；冷凍稀釋液

自從1949年發現甘油在雞精液的冷凍-解凍過程中的保護作用，家畜精液冷凍保存技術得到了飛速發展，牛的冷凍稀釋液的研究業已成熟，其商品化的精液冷凍稀釋液也多起來[1]。但是針對水牛的精液冷凍稀釋液研究較少，主要集中于印度和巴基斯坦等水牛數量相對較多的國家，我國關于水牛稀釋液的研究及應用基本集中在南方幾個省份：廣西、湖南、湖北、四川、云南等地。文章通過分析水牛精液冷凍稀釋液的成分，為水牛精液的冷凍保存提供參考。

1　營養成分

營養物質主要是給牛精子提供外源性的營養和能量，以延長精子的壽命。由于牛精子的代謝過程只是簡單的分解作用，不能利用復雜的合成作用將外源物質轉變其自身成分，所以稀釋液中的營養成分必須是最簡單的能源物質。現在奶牛精液稀釋液中一般添加葡萄糖、果糖、蔗糖、雞卵黃、奶類等，水牛稀釋液基本上參照奶牛，但是近年來在水牛上也有不少關于應用其他物質代替單糖類、雞卵黃的研究。易康樂在水牛精液冷凍稀釋液中分別添加鵪鶉卵黃和雞卵黃，試驗結果發現：稀釋液中添加鵪鶉卵黃的水牛精子解凍后其活力、分裂率和囊胚孵化率都顯著優于雞卵黃組（＜0.05）[2]。近年來因卵黃內可能攜帶病原菌的隱患，現國外生產的一些稀釋液中采用大豆卵磷脂代替卵黃。Akhter等在水牛精液稀釋液中分別添加5.0％、10％、15％的大豆卵磷脂和20％的雞卵黃，結果發現水牛精液冷凍-解凍后添加的10％大豆卵磷脂精子受胎率顯著高于添加20％的卵黃組（≤0.05）。金海關于無動物源性水牛精液冷凍稀釋液的研究中，用大豆卵磷脂代替卵黃，發現3％大豆卵磷脂的冷凍精子的運動速度比卵黃稀釋液解凍后的差異顯著，其他方面與卵黃稀釋液沒有明顯差異。

2　緩沖和維持滲透壓成分

公牛體內精液微環境的pH值一般在6.4～7.8之間，精液的pH值和稀釋液的pH值的變化，將直接影響到精子的活力。精液冷凍保存時，在稀釋液中添加適量的緩沖物質，如檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉等，這些弱酸鹽類在溶液中能夠維持酸堿平衡，從而有利于精子存活。在牛精液冷凍稀釋液中常用磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris或者幾種鹽類組合來調節pH值。易康樂比較了TRIS、TEST、EYC三種不同的緩沖液對凍后水牛精子的影響，結果表明這三種緩沖液都能用于水牛凍精生產，但Tris和Tes這兩種緩沖成分對水牛精子的保護作用更明顯［2］。國外許多學者在水牛稀釋液的研究中大多都以Tris-檸檬酸鈉-卵黃作為基礎液，Tris-檸檬酸鈉緩沖體系能夠調節精液的pH值，維持精液酸堿平衡，從而延長家畜精子的存活時間[3]。

一般認為精子周圍的微環境基本上是等滲的，如果精子生存的液體環境滲透壓升高將會導致精子內部脫水；如果其液體環境滲透壓過低則將會導致精子膨脹進而死亡，所以維持精子微環境一定的滲透壓是十分重要的。調節pH值的緩沖鹽類和糖類對精液的滲透壓維持具有重要作用，Chaveiro等研究表明，在公牛精液中添加Tris和蔗糖的稀釋液維持滲透壓效果比較理想。但是某些電解質或非電解質會破壞精子的等滲壓環境，對精子產生刺激和損傷，例如添加甘油的稀釋液會使精液滲透壓升高，進而因高滲沖擊使精子受損，水牛精子相對黃牛來說抵抗力較差，體外存活時間短，對緩沖和維持滲透壓物質要求相對要高，但當前針對水牛精液的特點研發的稀釋液配方較少。

3　抗凍和防休克成分

精液在體外冷凍保存時，需要由常溫降至零度以下，溫度驟降形成的冷刺激或者物態變化，將會使精子遭受冷休克或凍害而死亡，因此稀釋液中添加的抗凍或防休克物質能夠保護精子在溫度驟降過程中不受損害。稀釋液中添加的卵黃就具有防凍和冷休克的作用，許多研究表明，卵黃因其含有卵磷脂或者LDL（低密度脂蛋白）等物質所以可以保護精子頂體和質膜的完整性，從而防止精子冷凍或冷休克的發生。近年來，關于利用LDL來取代卵黃的報道也有不少。胡建宏等研究報道，牛精液稀釋液中用8％LDL取代20％雞蛋黃，其精子凍后活力、運動等方面效果明顯提高。Akhter等將尼里水牛的精液用含有LDL的稀釋液稀釋，添加20％雞蛋黃的稀釋液作對照，結果發現添加10％LDL的水牛精子解凍后的活力、質膜完整性和受胎率均顯著高于20％的卵黃對照組[4]。

精液冷凍稀釋液中最常用的防凍劑是甘油，大多數學者認為甘油是目前稀釋液中抗凍效果最好的，但是甘油的添加量必須適中，太少不能起到保護作用，太多容易造成精子滲透性損傷或使精子中毒。張鵬等研究報道，荷斯坦種公牛稀釋液中添加4％的甘油濃度對精子凍后活率和頂體完整性效果最好。考慮到甘油對精子的毒性，一些研究中用乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜等來代替甘油，效果不盡相同。Rasul等將甘油和二甲亞砜按不同的比例添加到尼里水牛精液的稀釋液中，結果發現，僅添加6％甘油的水牛精子解凍后其活力和質膜完整性效果最好，二甲亞砜反而會降低甘油對水牛的冷凍保存效果。

4　抗菌成分

精液如果被微生物污染會導致精子活力降低，存活時間縮短，并且人工授精后極易造成胚胎的早期死亡，從而使牛受胎率降低，所以在牛冷凍精液生產過程中必須控制凍精的細菌含量不超標。牛凍精稀釋液中一般添加如青霉素、鏈霉素等抗生素來抑制精液中細菌的生長。由于精液中微生物的種類很多，若使用單一的抗生素則不能達到抑菌的效果，因此現在稀釋液中常用的是各種抗生素的組合，目前水牛中常用的是青-鏈霉素組合。Hasan等研究報道，水牛精液稀釋液中添加慶大霉素-泰樂菌素-林可霉素-壯觀霉素（GTLS）抗生素組合，其細菌數要明顯比青-鏈霉素組的低。易康樂等研究報道，GTLS抗生素組合抑菌效果顯著好于青-鏈霉素組和青-新霉素組。金海使用不同濃度的GTLS抗生素組合代替青-鏈霉素，結果證實×1倍的GTLS抗生素組合效果最好。

5　抗氧化成分

在冷凍-解凍的有氧環境中脂質過氧化反應會產生過多的活性氧成分，從而增加了受損精子和死亡精子的數量，導致凍后精液質量的下降。在稀釋液中添加抗氧化物質可以提高精子抗過氧化損害的能力，防止解凍后精液質量下降，目前牛稀釋液中常添加維生素類、酶類等抗氧化成分。易康樂等在水牛精液冷凍稀釋液中添加不同的維生素組分，結果發現，3 ml/100 ml的復合VB、2 mg/L的VB12和1.0 mg/L VC能較顯著提高水牛凍精的活力（＜0.05）。雷虹等研究也證實添加的3 mL/100mL復合VB可以提高解凍后水牛精子的活力和頂體完整率。易康樂在水牛精液稀釋液中添加SOD和GSH，發現它們可以顯著延長水牛精子的存活時間。

6　其他

為了改善家畜精子生存環境的理化特性，減輕精子冷凍-解凍過程的各種損害，牛精液冷凍稀釋液中常常還加入一些酶類、維生素、激素類及其他物質，以提高精子復蘇后的活力、保持頂體的完整性等，從而增強牛精子在人工授精時的受精能力。近年來水牛精液稀釋液中也有相關添加其他物質的報道。Dorostkar等人將不同濃度的硫酸鋅添加到水牛稀釋液中，結果表明，0.288 mg/L的硫酸鋅對水牛精子的冷凍保存效果和抗氧化能力較好。Qadeer等將AFGP（抗凍糖蛋白）添加到尼里水牛精液的稀釋液中，結果發現精液冷凍-解凍后水牛的精子活力和質膜完整性有了顯著提高。

雖然牛精液冷凍稀釋液的成分和生產工藝業已成熟，但是如何根據不同種類的公牛精液的理化特點，設計適合該類種公牛的精液冷凍稀釋液，仍是今后牛精液冷凍保存技術中需要克服的一個重要難題。

參考文獻：

［1］潘紅梅,羅敏,王可甜,等.畜禽精液冷凍稀釋液主要成分的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2010,（01）：21-22.

［2］易康樂.水牛冷凍精液稀釋液配方改進的研究[D].南寧：廣西大學,2005.

［3］Andrabi SM1,Ansari MS,Ullah N,et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa[J].Anim Reprod Sci.2008,104(2-4):427-433.

［4］Akhter S,Ansari MS,Andrabi SM.Soya-lecithinin extender improves the freezability and fertility of buffalo (Bubalus bubalis)bullspermatozoa.Reprod Domest Anim.，2012，47(5):815-819.

作者簡介：付平（1979-），女，湖北南漳人，畜牧師，主要從事家畜繁育工作。

中圖分類號：S823

文獻標識碼：A

文章編號：1006－799X（2016）01-0008-02