動物溫度依賴型性別決定中的表觀遺傳學機制

滑留帥，茹文秀，白獻曉，龔世平

（1.廣東省生物資源應用研究所，廣東 廣州 510260；

2.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所；

3.西北農林科技大學動物科技學院）

專論綜述

動物溫度依賴型性別決定中的表觀遺傳學機制

滑留帥1，2，茹文秀1，3，白獻曉2，龔世平1*

（1.廣東省生物資源應用研究所，廣東 廣州 510260；

2.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所；

3.西北農林科技大學動物科技學院）

性別決定是生物學的一個核心問題，其中動物的溫度依賴型性別決定（TSD）是一個復雜而有趣的生物學現象。激素和性別決定相關基因在動物TSD中的調控作用已經有較為全面的研究，但是激素水平和性別決定相關基因如何響應環境溫度的變化仍不明確。最近的表觀遺傳學研究表明，環境溫度通過表觀遺傳修飾的方式改變性別決定相關基因的表達變化，可能是動物TSD的重要調控方式。例如，芳香化酶是合成雌激素的限速酶，而溫度誘導的芳香化酶基因啟動子區甲基化是黑鯛魚和紅耳龜等TSD動物性別決定的關鍵；除甲基化修飾外，ncRNAs和組蛋白修飾均被證明參與了GSD動物的性別決定過程，但是對于TSD動物來講，環境溫度如何影響機體的ncRNAs和組蛋白修飾水平仍缺乏足夠的研究。進一步探討TSD中的表觀遺傳學機制，對于理解動物的性別決定生物學過程具有重要的意義。

溫度依賴型性別決定；表觀遺傳修飾；甲基化；ncRNAs；組蛋白修飾

性別決定是生物學的一個核心問題，性別決定過程不僅能夠影響個體的發育方向，而且能夠影響種群的結構、動態和命運［1］。動物的性別決定是由遺傳因子和外界環境共同決定的，基本上可以分為兩種類型：遺傳型性別決定（GSD）和環境型性別決定（ESD）。其中GSD類型的動物在受精時就已決定了個體的初始性別，主要包含的類型有：①XX/XY型，如哺乳動物，具有XX同型染色體為雌性，具有XY異型染色體為雄性；②ZZ/ZW型，如鳥類，具有ZZ同型染色體為雄性，具有ZW異型染色體為雌性。ESD類型動物的性別則由其受精后胚胎所處的環境條件決定，包括：溫度、pH值、鹽分含量等，甚至群體性比、病原體等。在脊椎動物中ESD的一種主要表現形式為溫度依賴型性別決定（TSD），即個體性別依賴于胚胎發育過程中的環境溫度，TSD在魚類和爬行類動物中最為常見。

1 動物TSD調控機制的研究現狀

1.1 TSD的分類

動物的TSD基本上可以分為三種類型［2］：①TSD Ia（MF）型：即低溫產雄性，高溫產雌性。TSD Ia是動物TSD的主要類型，例如常見的烏龜、紅耳龜、錦龜等都屬于此類別；②TSD Ib（FM）型：即低溫產雌性，高溫產雄性。TSD Ib在部分蜥蜴、多種魚類中有過報道；③TSD II（FMF）型：即低溫和高溫均產雌性，中間溫度產雄性。在龜鱉類、蜥蜴類和鱷類中都存在有TSD II模式。

1.2 激素在TSD中的調控機制

動物的性別決定包括兩個方面：一是性腺的決定和發育，稱為初級性別決定，主要包括原始性別的決定、性腺的發育；二是附屬性器官、特征及性行為的建立稱為次級性別決定，主要包括在動物體內睪丸或卵巢形成后，由各自的性腺或者生殖腺分泌性激素來促使相關組織、附屬組織和器官的發育以及性行為的形成和建立。對于TSD動物來講，激素在初級性別決定和次級性別決定過程中都起了關鍵的作用，在產生雄性的孵化溫度下，睪酮（T）由5α-還原酶作用轉化為雙氫睪酮（DHT），然后經過級聯反應最終誘導胚胎發育成雄性幼體；在產生雌性的孵化溫度下，睪酮由芳香化酶作用轉化為雌二醇（E2），然后經過一系列反應最終誘導胚胎發育成雌性幼體。在卵孵化過程中，使用外源雌激素處理，可以誘導處于雄性孵化溫度中的胚胎發育成雌性。但是，使用外源雄激素處理卻不能誘導雌性孵化溫度中的胚胎發育成雄性。可能因為睪酮被芳香化酶催化后轉換成了雌激素；如果利用芳香化酶抑制劑抑制其作用，則可在雌性溫度條件下產生雄性胚胎。激素在TSD中的調控作用已經基本明確，但是激素水平響應環境溫度的具體分子機制仍不確定。

1.3 性別決定相關基因與TSD

早期研究認為動物的TSD和GSD為2種獨立的性別決定系統，新的研究表明兩者并非完全獨立，而是具有一定的關聯性。比較基因組分析表明，許多在GSD動物中調控性腺分化的基因在TSD動物中都是保守的，且進一步的功能驗證表明，它們在TSD動物的性別決定中大多還擁有類似的調控功能，提示TSD和GSD在分子水平可能采用了相同的調控通路。目前已經驗證的性別決定相關基因包括：Sox9、Sf-1、Dmrt1、Wt1、Wt4、Dax1、FoxL2、Cyp19a1、Mis等［3］。這些基因在GSD和TSD動物中都是性別決定的關鍵調控因子，但對于TSD動物來講，比較特別的地方在于，環境變化對部分性別決定基因的表達水平具有決定性的作用，從而能夠決定胚胎的性別。與激素調控TSD的研究類似，這些性別決定相關基因在TSD動物中如何響應環境溫度變化仍不明確。

2 表觀遺傳修飾在TSD中的調控機制

表觀遺傳是指DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變。表觀遺傳修飾很大程度上介導了機體對環境變化的響應，同時也整合了環境與基因組信息來產生特定的表型。近期的研究表明，環境溫度通過表觀遺傳修飾的方式改變性別決定相關基因的表達變化，可能是TSD的重要調控方式。表觀遺傳修飾主要包括三種方式：DNA甲基化、非編碼RNA和組蛋白修飾調控。通常情況下，表觀遺傳修飾都不是單獨發生的，這三種機制往往存在交互作用，共同調控目的基因的表達，進而參與了植物、無脊椎動物或脊椎動物的性別決定和性腺分化。

2.1 DNA甲基化在TSD中的調控作用

DNA甲基化往往發生在基因的啟動子區或調控區域，DNA甲基化能夠通過抑制基因的轉錄來調節基因的功能。環境變化可能通過改變ESD動物性別決定相關基因的甲基化修飾模式來決定后代的性別。近期我國的學者對半滑舌鰨的全基因組進行了測序，并分析了全基因組的甲基化修飾與性別決定的關系。半滑舌鰨屬于ZZ/ZW性別決定類型，正常雌魚在溫度控制之下能夠發生性逆轉而變為偽雄魚。性逆轉后偽雄魚全基因組的DNA甲基化模式變得跟正常雄魚幾乎一模一樣，而且，DNA的甲基化主要富集在與性別決定通路有關的基因上。半滑舌鰨的證據進一步從基因組水平證明了甲基化修飾在性別決定調控中的重要性。在非哺乳類的脊椎動物中，芳香化酶（Cyp19a1）是將雄激素轉化為雌激素的關鍵酶，從而參與調控雌性的卵巢發生。在許多魚類和爬行動物中，溫度誘導的雄性化都與Cyp19a1的表達抑制相關聯，而最近的研究表明Cyp19a1基因啟動子區的甲基化可能是連接溫度變化和性別決定的橋梁。例如歐洲鱸魚的性別是由環境和遺傳共同調控的，其性別決定的溫度敏感期（TSP）位于幼體期，溫度誘導的雄性化被證明與Cyp19a1基因啟動子區的甲基化水平上升相關聯，但是溫度變化伴隨的Cyp19a1基因啟動子區的甲基化只能在性腺中檢測到，而在大腦中檢測不到，說明該甲基化對溫度的響應還具有組織特異性。溫度誘導的Cyp19a1基因啟動子區甲基化模式還存在一定的物種間保守性，例如在黑鯛魚和紅耳龜的性別決定過程中，Cyp19a1基因啟動子區甲基化修飾也起到關鍵的調控作用。相對于Cyp19a1基因，Sry基因是哺乳動物睪丸發育的關鍵調控基因，小鼠上的研究表明DNA甲基化對Sry的時空表達具有重要的調控作用。烏龜是典型的TSD Ia型爬行動物，烏龜的Sox9基因（爬行動物的Sry同源基因）在雄性孵化溫度下存在顯著高表達［4］，但是爬行動物Sox9基因的表達是否接受DNA甲基化調控需要進一步的試驗驗證。對其余TSD動物來講，筆者推測甲基化修飾可能是其溫度依賴型性別決定的重要調控機制之一，通過改變啟動子區的甲基化修飾水平，性別決定基因能夠響應孵化溫度的變化，改變其表達水平，進而決定了性腺的發育方向，但這樣的推測需要進一步的試驗驗證。

2.2 ncRNAs在TSD中的調控作用

除了甲基化修飾外，ncRNAs也是動物性別決定的重要調控方式。ncRNAs是指不翻譯為蛋白質的有功能的RNA分子，被認為是表觀遺傳修飾的重要組成方式。參與表觀遺傳調控的ncRNAs主要有兩類：長非編碼RNAs（lncRNAs；＞200 nt）和小RNAs（miRNAs；19-25 nt）。ncRNAs通過招募表觀遺傳沉默復合體進而結合在基因組或轉錄組的同源位點來實現對目標基因的表達調控。ncRNAs在植物、昆蟲、魚類、鳥類、哺乳動物中均被證明參與了性別決定的過程。例如在大西洋大比目魚中多個miRNAs的表達水平存在性別差異，且當使用芳香化酶抑制劑誘導動物雄性化后，部分miRNAs的表達水平也相應地發生了改變，提示部分miRNA參與了激素調控的信號通路。在雞的性別決定過程中，miR-202*在雄性中高表達，從而推測其與雞的睪丸發育相關。給發育至4.5 d的雄性胚胎（ZZ）注射雌激素（E2）誘導其雌性化時，能夠觀測到miR-202*的表達顯著降低，同時還能觀測到睪丸生成調控基因Dmrt1和Sox9的表達下調，而卵巢生成調控基因FoxL2和Cyp19a1的表達則顯著上調。相反的，用芳香化酶抑制劑處理3.5 d的雌性胚胎（ZW）時，能夠觀測到miR-202*的表達顯著上調，同時伴隨的還有Dmrt1和Sox9的上調以及FoxL2和Cyp19a1的下調。雖然目前已經證明ncRNAs參與了動物的性別決定過程，并已經鑒定了許多雌雄間差異表達的ncRNAs，但是這些結果多是在GSD動物中被發現。關于TSD動物中的ncRNAs的研究尚未見報道，有哪些ncRNAs尤其是miRNAs參與了TSD的調控過程，這些ncRNAs的表達如何響應孵化溫度的變化，以及這些ncRNAs如何與已知的性別決定基因互作都是未知的，闡明這些問題有助于進一步深入理解動物TSD的分子調控機制。

2.3 組蛋白修飾在TSD中的作用機制

核小體是染色質的基本組成單位，由一個組蛋白八聚體（由4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4組成，每一種組蛋白各二個分子）、一個H1組蛋白和一段DNA構成。組蛋白修飾在轉錄水平對基因表達存在調控作用，例如，H3K9me（組蛋白H3第9位賴氨酸甲基化）是H3的重要修飾方式，其能夠參與異染色質的形成和轉錄沉默過程。許多參與組蛋白修飾的酶對于外界環境變化都很敏感，因此能夠介導環境變化對基因表達的影響。缺乏H3K9去甲基化酶的XY小鼠，常常表現出性逆轉特征或徹底發育為不育的雌性小鼠。基因表達分析表明，H3K9去甲基化酶的缺失顯著下調了胚胎發育期Sry基因的表達水平。而在野生型的XY小鼠中，體細胞的Sry位點有大量的H3K9去甲基化酶聚集，進而導致H3K9me2的升高和H3K4me3的降低。這些證據均證明組蛋白修飾在動物性別決定中可能有的重要作用。PcG蛋白是一組通過染色質修飾調控靶基因的轉錄抑制子，在小鼠上的同源基因為CBX2，CBX2突變型小鼠有一半會在斷奶前死掉，而剩余的則表現出性腺發育不全和雄性到雌性的性逆轉。性腺生長缺陷出現的時間與Sry表達的時間相一致，說明CBX2缺陷引起的性逆轉可能與Sry的表達有關。進一步通過蛋白質組和免疫組化分析表明，一系列的轉錄因子，包括Sry、Sox9、Lhx9、Ad4BP/SF-1、Dax-1、Gata4、Arx和Dmrt1的表達均受到CBX2基因敲除的影響。在CBX2基因敲除小鼠中過表達Sry或Sox9基因，能夠挽救雄性到雌性的性逆轉，這說明CBX2通過Sry基因表達參與了睪丸的發育。對于TSD動物來講，進一步分析環境溫度如何參與組蛋白的修飾過程，或者參與組蛋白修飾的酶的表達量、活性和結合位點如何響應孵化溫度的變化，可能是研究組蛋白修飾參與TSD調控的關鍵。

3 結語

綜上所述，動物的溫度依賴型性別決定（TSD）是一個復雜而有趣的生物學現象，但其具體的生物學機制仍不明確。表觀遺傳修飾很大程度上介導了機體對環境變化的響應，環境溫度通過表觀遺傳修飾的方式改變性別決定相關基因的表達變化，可能是動物TSD的一種重要調控方式。進一步分析DNA甲基化、ncRNAs表達和組蛋白修飾如何響應孵化溫度的變化；DNA甲基化、ncRNAs和組蛋白修飾之間如何互作；DNA甲基化、ncRNAs和組蛋白修飾如何調控性別決定相關基因和性激素的表達變化，對于理解動物性別決定的生物學過程具有重要的意義。

［1］杜衛國，孫寶珺.爬行動物溫度決定性別的現象與機制.生物學通報，2012，47（3）：1-5.

［2］賀斌，史海濤，廖廣橋.龜鱉類溫度依賴型性別決定機制的研究進展.動物學雜志，2009，44（5）：147-152.

［3］李簫，翁靜.哺乳動物性別決定相關基因及其調控機制.生殖醫學雜志，2015，24（3）：245-250.

［4］湯文琦.孵化溫度對烏龜性別決定基因表達的影響［D］.杭州師范大學，2013.

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1004-5090（2016）09-0011-03

2016-08-16）