運(yùn)動訓(xùn)練對腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)新生的影響①

方杰，胡昔權(quán)

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運(yùn)動訓(xùn)練對腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)新生的影響①

方杰1，胡昔權(quán)2

[摘要]目的探討大鼠腦梗死后跑籠訓(xùn)練對室管膜下區(qū)神經(jīng)新生及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，線栓法阻塞左側(cè)大腦中動脈建立腦梗死模型，隨機(jī)分為對照組(n=24)和訓(xùn)練組(n=24)，兩組再分為3 d、7 d、14 d和21 d亞組，每個亞組6只。對照組于普通籠內(nèi)飼養(yǎng)，不做任何針對性訓(xùn)練；訓(xùn)練組予跑籠訓(xùn)練每天2次，共3周。各亞組于預(yù)定時間采用神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重程度量表(NSS)評估神經(jīng)功能，取材行Ki67免疫熒光染色。結(jié)果14 d和21 d時，訓(xùn)練組Ki67陽性細(xì)胞數(shù)較對照組增多(P<0.05)。7 d后，訓(xùn)練組NSS評分低于對照組(P<0.05)。結(jié)論腦梗死后跑籠訓(xùn)練可促進(jìn)大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)新生，可能在腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]腦梗死；運(yùn)動訓(xùn)練；神經(jīng)新生；大鼠

作者單位：1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東廣州市510260；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東廣州市510630。作者簡介：方杰(1984-)，男，漢族，安徽淮南市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：康復(fù)醫(yī)學(xué)與理療學(xué)。通訊作者：胡昔權(quán)，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: xiquhu@hotmail.com。

[本文著錄格式]方杰，胡昔權(quán).運(yùn)動訓(xùn)練對腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)新生的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2016, 22(1): 8-12.

CITED AS: Fang J, Hu XQ. Effect of wheel running on neurogenesis in subventricular zone of adult rats post cerebral ischemia [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 8-12.

一直以來，成年哺乳動物神經(jīng)元被認(rèn)為是永久性細(xì)胞，受損后無法恢復(fù)，僅能通過膠質(zhì)細(xì)胞填充，并且隨著年齡增長逐漸退化和減少。1992年，Reynolds等從成年小鼠紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖、具有多種分化潛能的細(xì)胞群，提出了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)的概念[1]。成年哺乳動物的NSCs主要存在于側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)、紋狀體和海馬齒狀回(dentategyrus,DG)。已有研究證實，腦缺血等病理刺激可激活成體腦內(nèi)NSCs增殖[2]。

目前國內(nèi)外研究大多側(cè)重于腦缺血對NSCs激活的影響，也有少數(shù)研究針對腦缺血后運(yùn)動訓(xùn)練對海馬齒狀回NSCs增殖的影響。本研究探討腦梗死后運(yùn)動訓(xùn)練對室管膜下區(qū)NSCs增殖的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

清潔級雄性成年Sprague-Dawley大鼠70只，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號SCXK(粵) 2008-0002，體質(zhì)量230～250g，3月齡。造模后符合納入標(biāo)準(zhǔn)的大鼠48只，隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、訓(xùn)練組各24只，再分為術(shù)后3 d、7 d、14 d和21 d，每時間點6只。所有動物均普通籠飼養(yǎng)，予充足飲食，每天日照12 h，室溫(25±3)℃。

1.2模型制備

大鼠術(shù)前禁食12 h。采用Longa等的線栓法[3]制作永久性左側(cè)大腦中動脈閉塞模型。3.5%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，取頸正中切口，鈍性分離皮下筋膜及甲狀腺，將左側(cè)甲狀腺外翻并保護(hù)固定。充分暴露視野，分離大鼠左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈主干和頸總動脈近心端，并在頸總動脈遠(yuǎn)心端備線，分離頸內(nèi)動脈至翼腭動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈近心端，在頸總動脈主干分叉處剪一約0.2 mm的“V”形切口，插入頂端稍有膨大的尼龍線栓(北京沙東生物科技有限公司)，緩慢推進(jìn)至線栓頂端有阻力感，插入深度從頸總動脈分叉處計算約(18±0.5) mm，使線栓經(jīng)頸總動脈分叉部順利通過頸內(nèi)動脈，越過大腦中動脈開口處，到達(dá)大腦前動脈起始部。結(jié)扎備線，復(fù)位甲狀腺，關(guān)閉縫合切口。麻醉清醒后回籠，自由進(jìn)食。

動物清醒后采用改良Bederson標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0分，無神經(jīng)功能缺失體征；1分，提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；2分，前肢屈曲及對側(cè)抵抗力下降；3分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙。選擇蘇醒后出現(xiàn)左眼Honer氏征陽性、Bederson評分1～3分的大鼠納入研究。

1.3運(yùn)動訓(xùn)練

采用自行研發(fā)的實驗動物跑籠訓(xùn)練器。跑籠直徑20 cm，長40 cm，由電動馬達(dá)帶動，控制器設(shè)定轉(zhuǎn)速、時間或路程。訓(xùn)練組造模48 h后開始訓(xùn)練，采用階梯式遞增訓(xùn)練法，初始轉(zhuǎn)速5 r/min，每次15 min，每天2次。7 d后逐步增加為5 r/min，10 min；10 r/min，5 min；15 r/min，10 min；每天2次。14 d后逐步增加為15 r/min，10 min；20 r/min，10 min；15 r/min，10 min；每天2次。

對照組不進(jìn)行干預(yù)，自由活動。

1.4神經(jīng)功能評分

術(shù)后3 d、7 d、14 d和21 d采用神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重程度量表(neurological severity scores, NSS)[5]進(jìn)行評定。該量表包括運(yùn)動功能、感覺功能、平衡和反射缺失、異常運(yùn)動4部分，共18分。1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

1.5免疫熒光染色

大鼠3.5%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，剪開前胸壁，縱向剪開心包，充分暴露心臟。肝素鈉0.2 μl抗凝，在心尖偏左處左心室插管至升主動脈，止血鉗固定針頭，剪開右心耳，快速滴入4℃生理鹽水50～100 ml沖洗，4℃4%多聚甲醛200～250 ml灌注固定，先快后慢，40 min灌注完。立即開顱取腦，組織塊后固定在4%多聚甲醛中。腦組織分別置20%、30%、40%梯度蔗糖磷酸鹽緩沖溶液內(nèi)，直到組織塊沉底。取出組織，恒冷箱切片機(jī)由顱至尾依次連續(xù)切片，片厚20 μm，隔4片取1片，裱于玻片上，行免疫熒光染色。

冰凍切片晾干后，0.01 mol/L PBS (pH=7.4)漂洗3次，每次5 min；置煮沸的0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中(pH=6.0)，微波加熱持續(xù)煮沸20 min，室溫冷卻；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；3% H2O2室溫5 min；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；1% TritonX-100室溫下破膜30 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；加入山羊血清，室溫封閉30 min；棄去血清，加入兔Ki67單克隆抗體(ABACAM，1∶1000)，4℃過夜，棄去一抗；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔Cy3 (PROTEINTECH，1∶100)，避光孵育1 h；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；室溫下晾干。抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。每只動物取3張切片，400倍鏡下隨機(jī)取3個視野，使用Image-pro plus 6.0軟件計數(shù)Ki67陽性細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(±s)表示，行單因素方差分析(One-way analysis of variance)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

兩組造模3 d后NSS評分逐漸下降。術(shù)后3 d時，兩組間評分無顯著性差異(P>0.05)；從術(shù)后7 d開始，訓(xùn)練組NSS評分低于對照組(P<0.05)。組內(nèi)比較，對照組3 d和7 d的NSS評分無顯著性差異(P>0.05)，14 d后降低(P<0.05)；訓(xùn)練組術(shù)后7 d即有降低(P< 0.05)。見表1。

兩組從術(shù)后3 d開始出現(xiàn)Ki67陽性細(xì)胞，7 d達(dá)到高峰，14 d后增殖水平逐漸下降(圖1)。術(shù)后3 d和7 d，兩組間Ki67陽性細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后14 d和21 d，訓(xùn)練組Ki67陽性細(xì)胞數(shù)多于對照組(P<0.05)。組內(nèi)比較，訓(xùn)練組術(shù)后3 d與14 d時，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，其余各時間間均有顯著性差異(P<0.05)；對照組各時間點間Ki67陽性細(xì)胞數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表1　兩組不同時間點NSS評分比較

表2　兩組不同時間點Ki67陽性細(xì)胞數(shù)比較

圖1　各組不同時間點Ki67表達(dá)(免疫熒光染色, bar=50 μm)

3　討論

NSCs是來源于神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我維持或自我更新能力，并可向神經(jīng)組織多細(xì)胞系(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)分化的細(xì)胞。目前，利用NSCs修復(fù)缺血性腦損傷主要有兩種途徑：移植外源性NSCs和激活內(nèi)源性NSCs。NSCs移植面臨成瘤風(fēng)險、毒性、免疫排斥以及社會倫理等問題，應(yīng)用受到限制；誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs逐漸成為研究熱點。

哺乳動物成年后，NSCs主要存在于側(cè)腦室壁室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層。一般認(rèn)為，腦室下區(qū)-頭側(cè)突起-嗅球系統(tǒng)中，腦室下區(qū)新生的NSCs由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包裹，并沿腹側(cè)遷移通路向嗅球方向遷移，形成成熟的中間神經(jīng)元[6]。在顆粒細(xì)胞下區(qū)-顆粒細(xì)胞層系統(tǒng)中，顆粒細(xì)胞下區(qū)新生的NSCs在遷移過程中，逐漸分化為前體細(xì)胞進(jìn)入顆粒細(xì)胞層，進(jìn)一步形成神經(jīng)細(xì)胞[7]。

目前鑒定NSCs最常用的方法是免疫組化示蹤法，利用細(xì)胞增殖標(biāo)記物，如胸腺嘧啶核苷類似物5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU)，多由腹腔注射至動物體內(nèi)[8]。BrdU可在細(xì)胞周期的S期摻入細(xì)胞核DNA內(nèi)，通過免疫組化染色進(jìn)行檢測。

但這種方法存在著一些爭議和不足。首先，此種標(biāo)記方法屬于有創(chuàng)性操作，對動物產(chǎn)生一定的刺激，僅限用于活體動物；而且隨著操作人員的技術(shù)、方法以及劑量掌握而存在差異，增加了實驗的干擾因素。其次，BrdU的摻入只意味著有DNA合成，不一定存在細(xì)胞分裂，受損的DNA在進(jìn)行修復(fù)時，或處于即將衰老凋亡的細(xì)胞周期，核苷類似物也可以摻入其內(nèi)，BrdU無法區(qū)分正處于修復(fù)、即將死亡和增殖細(xì)胞[9]。此外，注射入動物體內(nèi)的BrdU是否會隨著細(xì)胞的分裂增殖而衰減或被稀釋，也存在一定爭議。

隨著NSCs研究的深入，Ki67開始逐漸廣泛應(yīng)用于NSCs的研究中[10-12]。Ki67在細(xì)胞周期的G1后期、S期、G2期和M期細(xì)胞核表達(dá)，是內(nèi)源性抗原，可直接進(jìn)行免疫組化檢測；相比外源性注射抗原，表達(dá)部位和表達(dá)量更加穩(wěn)定；且只表達(dá)于增殖中的細(xì)胞，不會出現(xiàn)于修復(fù)期或即將衰亡的細(xì)胞中，是理想的NSCs鑒定標(biāo)記物之一。

成年哺乳動物體內(nèi)NSCs數(shù)量極少，僅依賴自發(fā)的內(nèi)源性NSCs修復(fù)腦損傷遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。提高內(nèi)源性NSCs的增殖水平，是缺血后神經(jīng)再生的基礎(chǔ)。目前研究認(rèn)為，激活NSCs的因素如下。

內(nèi)源性因素指可以對外界信號發(fā)生反應(yīng)，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)自身NSCs的因素，包括一些NSCs內(nèi)的蛋白成分、神經(jīng)營養(yǎng)因子等。另外，一些轉(zhuǎn)錄因子和基因的激活與沉默也可介導(dǎo)NSCs向特定的終末方向分化。各種生長相關(guān)的因子、離子、激素以及神經(jīng)介質(zhì)，也都是NSCs賴以存在和分化的必要因素。

外源性因素包括葡萄糖、氨基酸、維生素等，是維持細(xì)胞存活的基本元素，任何物質(zhì)的缺乏都會導(dǎo)致NSCs功能喪失甚至死亡。細(xì)胞間各種因素的協(xié)調(diào)平衡、滲透壓、pH值、氧濃度和溫度等都對NSCs的增殖、遷移以及分化產(chǎn)生重要影響。病理狀態(tài)如腦缺血也是NSCs的激活因素[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后10 d 和30 d分別在室管膜下區(qū)和腹側(cè)遷移通路出現(xiàn)細(xì)胞增殖高峰，在30 d和60 d可在嗅球檢測到BrdU和NeuN雙陽性細(xì)胞，提示NSCs的增殖、遷移和分化[14]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，給予腦梗死動物運(yùn)動訓(xùn)練、豐富環(huán)境、電針[15]等刺激，也可以提高NSCs的增殖水平。

給予成年小鼠運(yùn)動訓(xùn)練后，可提高運(yùn)動功能、學(xué)習(xí)記憶能力[16]。該作用與激活海馬區(qū)神經(jīng)新生、改善突觸可塑性有關(guān)。本研究顯示，腦缺血發(fā)生后早期，對照組及訓(xùn)練組大鼠室管膜下區(qū)均出現(xiàn)大量Ki67陽性細(xì)胞，可能與損傷后的缺血缺氧狀態(tài)激活腦內(nèi)源性神經(jīng)新生有關(guān)。一段時間后，隨著細(xì)胞水腫的減輕、腦內(nèi)側(cè)支微循環(huán)的建立以及膠質(zhì)細(xì)胞填充、分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)因子，運(yùn)動功能逐漸恢復(fù)，同時神經(jīng)新生的增殖水平也明顯下降。而運(yùn)動訓(xùn)練有助于維持大鼠室管膜下區(qū)Ki67陽性細(xì)胞水平，雖然14 d時細(xì)胞的增殖水平較前有所下降，但仍明顯高于對照組。這一促進(jìn)作用可能與激活某些細(xì)胞信號通路，如Wnt通路等有關(guān)[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后運(yùn)動訓(xùn)練可通過激活基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及其受體(SDF-1α/CXCR4)軸，促進(jìn)NSCs增殖、遷移至損傷部位，發(fā)揮修復(fù)作用。相比訓(xùn)練組，對照組在14 d時，大鼠室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖水平較7 d時已明顯下降，21 d時進(jìn)一步下降，說明腦缺血損傷刺激對室管膜下區(qū)神經(jīng)新生的激活作用有限，無法發(fā)揮有效的修復(fù)作用。

神經(jīng)功能評估也發(fā)現(xiàn)，7 d、14 d和21 d訓(xùn)練組神經(jīng)功能優(yōu)于對照組。我們前期的研究顯示，運(yùn)動訓(xùn)練能促進(jìn)腦梗死大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)，且明顯優(yōu)于自然恢復(fù)[18-19]。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，提示腦梗死大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)可能與運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)腦缺血后室管膜下區(qū)神經(jīng)新生有關(guān)。

綜上所述，腦缺血后運(yùn)動訓(xùn)練可激活室管膜下區(qū)神經(jīng)新生，促進(jìn)NSCs增殖、遷移和分化，對受損的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)。今后應(yīng)加強(qiáng)對影響腦缺血后NSCs增殖、遷移和分化因素的研究，選擇合適的訓(xùn)練方式、訓(xùn)練強(qiáng)度以及訓(xùn)練介入時間，提高NSCs增殖水平和存活能力，促進(jìn)其向受損部位的遷移能力和向神經(jīng)元方向分化，重建正確的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

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Effect of Wheel Running on Neurogenesis in Subventricular Zone of Adult Rats post Cerebral Ischemia

FANG Jie1, HU Xi-quan2
1. Department of Rehabilitation, The Second Affiliated Hospital ofguangzhou Medical University,guangzhou,guangdong 510260, China; 2. Department of Rehabilitation, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,guangzhou,guangdong 510630, China
Correspondence to HU Xi-quan. E-mail: xiquhu@hotmail.com

Abstract:Objective To observe the effect of wheel running exercise on subventricular zone neurogenesis and the neural function in rats post cerebral ischemia. Methods 48 adult male Sprague-Dawley rats were induced cortical infarcts with left middle artery occlusion and were housed in either standard (controlgroup, n=24) or wheel running (exercisegroup, n=24). They were assessed with neurological severity scores (NSS), and the expression of Ki67 was determined with immunofluorescence, 3, 7, 14 and 21 days after training. Results Compared with the controlgroup, the number of Ki67-labeled cells in subventricular significantly increased in the exercisegroup 14 and 21 days after ischemia (P<0.05), and the NSS decreased since 7 days after ischemia (P<0.05). Conclusion Wheel running may promote the neurogenesis in subventricular of adult rats after cerebral infarction, which may associate with the recovery of neural function.

Key words:cerebral infarction; exercise; neurogenesis; rats

(收稿日期：2015-05-17修回日期：2015-09-30)

[中圖分類號]R743.32

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)01-0008-05

基金項目：1.國家自然科學(xué)基金項目(No.81071607)；2.廣東省科技計劃項目(No.2011B060300013)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.002