健步通絡(luò)熏蒸液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)的影響

劉紅杰，王鋼.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

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健步通絡(luò)熏蒸液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)的影響

劉紅杰1，王鋼2
1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

摘要：目的觀察健步通絡(luò)熏蒸液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）表達(dá)的影響，探討其關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用機(jī)制。方法26只新西蘭大白兔，隨機(jī)抽取6只作為空白組，余20只采用改良Hulth法制作骨關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后4周隨機(jī)抽取2只驗證造模是否成功，18只隨機(jī)分為模型組、熏洗組和降鈣素組。模型組采用自來水熏洗，熏洗組采用健步通絡(luò)熏蒸液熏洗，每次30 min，每日1次；降鈣素組給予降鈣素5 U/kg肌肉注射，每日1次，療程20 d。療程結(jié)束后行空氣栓塞致死，取關(guān)節(jié)軟骨觀察其大體形態(tài)，PCR檢測軟骨中ERK1/2含量。結(jié)果與空白組比較，模型組關(guān)節(jié)面損傷嚴(yán)重，ERK1/2含量顯著升高；熏洗組和降鈣素組關(guān)節(jié)面損害較輕，且ERK1/2表達(dá)降低；熏洗組與降鈣素組比較，2組關(guān)節(jié)面損害及ERK1/2表達(dá)無明顯差異。結(jié)論健步通絡(luò)熏蒸液對膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)、抑制軟骨退變的作用，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：健步通絡(luò)熏蒸液；骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；兔

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的老年性關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的疾病，發(fā)病率逐年升高，膝關(guān)節(jié)最為常見。其中特征性、最基本的病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的變性，加之骨贅形成、滑膜炎癥，從而導(dǎo)致一系列與之相關(guān)的臨床癥狀。OA屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇。中醫(yī)治療OA歷史悠久，方法各異。健步通絡(luò)熏蒸液為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床觀察其具有治療OA的作用[1]。本實(shí)驗采用改良Hulth法制作OA模型，觀察健步通絡(luò)熏蒸液對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1　實(shí)驗材料

1.1動物

4～6月齡新西蘭大白兔26只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗科，合格證號SCXK-（軍）2012-0020，分籠飼養(yǎng)，自由喂食。

1.2藥物

健步通絡(luò)熏蒸液由透骨草20 g、伸筋草30 g、桑寄生30 g、杜仲30 g、羌活20 g、獨(dú)活20 g、川牛膝15 g、紅花15 g、當(dāng)歸10 g、赤芍10 g、川芎15 g、乳香20 g、沒藥20 g、制川烏10 g、制草烏10 g、土鱉蟲10 g、山楂10 g、五味子15 g等組成，飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。降鈣素，山東綠葉制藥有限公司，批號2013075。

1.3主要試劑與儀器

RT-RCR試劑盒（DBI公司），Trizol試劑（Invitrogen life technologies）。PCR儀（BIO-RAD S1000 Thermal Cycler公司），凝膠成像分析儀（Biobad），電泳儀（BIO-RAD公司），Q500微量紫外可見分光光度計（美國Quawell），HH.WZL.Cr42Ⅱ型電子恒溫三用水箱（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠），自制動物熏蒸裝置。

2　實(shí)驗方法

2.1造模

采用改良Hulth法制作OA模型[2]。術(shù)前常規(guī)備皮，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，取兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶和前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)后連續(xù)1周予青霉素20萬U肌肉注射，1周后每日被動驅(qū)趕兔子活動30 min，連續(xù)4周。

2.2分組

造模4周后，從20只造模的膝骨關(guān)節(jié)炎兔中隨機(jī)選取2只，行大體形態(tài)觀察及病理切片以驗證造模是否成功，余18只隨機(jī)分為模型組、熏洗組、降鈣素組，每組6只。另選6只作為空白組。

2.3干預(yù)

空白組、模型組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組、熏洗組均采用恒溫水箱進(jìn)行熏洗，模型組采用自來水進(jìn)行熏洗，熏洗組采用健步通絡(luò)熏蒸液進(jìn)行熏洗。根據(jù)人和動物等量換算公式計算藥物用量。將每劑中藥治療前加水500 mL浸泡30 min后，放入電飯鍋加熱，煮沸后再煮15 min。然后將藥汁倒入電恒溫水箱內(nèi)，將藥汁溫度控制在40 ℃，將預(yù)先準(zhǔn)備的籠屜放在電恒溫水箱上預(yù)熱10 min，將兔放入籠屜中，熏洗組每次30 min，每日1次，共20 d。降鈣素組給予降鈣素5 U/kg肌肉注射，每日1次，共20 d。

2.4標(biāo)本采集

干預(yù)結(jié)束后各組動物行空氣栓塞法處死，切開右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)囊，顯露關(guān)節(jié)軟骨，取右后肢內(nèi)側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面軟骨，軟骨標(biāo)本生理鹽水沖洗表面血跡后立即放入液氮中備用。

2.5觀察指標(biāo)

2.5.1關(guān)節(jié)軟骨組織大體形態(tài)觀察肉眼觀察右后肢股骨髁關(guān)節(jié)軟骨的變化情況，參照Pelletier JP[3]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。0分：關(guān)節(jié)面透明光整、色澤正常；1分：關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰黯；2分：關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表層和中層；3分：關(guān)節(jié)面有潰瘍，缺損深達(dá)軟骨深層；4分：軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。

2.5.2關(guān)節(jié)軟骨電鏡觀察標(biāo)本生理鹽水沖洗表面血跡后放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，15%乙二胺四乙酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣（每周更換1次脫鈣液），28 d后，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨變化。參照Mankin's評分標(biāo)準(zhǔn)評分，見表1。

表1　Mankin's評分標(biāo)準(zhǔn)

2.5.3細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)檢測采用Trizol提取軟骨組織中總RNA，先后檢測RNA純度濃度，根據(jù)A260/A280比值為1.8～2.0及28 s、18 s的亮度比值，估測RNA質(zhì)量。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA包括RNA變性、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR檢測基因片段。最終進(jìn)行凝膠成像分析，應(yīng)用Quantity one 4.61軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，計算相對灰度（目的基因灰度值÷β-actin灰度值×100%），分析所檢測基因的相對表達(dá)量。ERK1/2的引物設(shè)計由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計，見表2。

表2　引物基因序列

3　統(tǒng)計學(xué)方方法

采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗數(shù)據(jù)以x—±s表示，組組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意意義。

4　結(jié)果

4.1大體形形態(tài)觀察

空白組組關(guān)節(jié)軟骨外觀正常，軟骨表面光滑，顏色正常，無關(guān)關(guān)節(jié)面潰瘍及軟骨下骨質(zhì)暴露；模型組可見關(guān)節(jié)軟骨表表面粗糙不平，顏色偏黯，軟骨缺損糜爛并可見關(guān)節(jié)邊邊緣有大量骨贅形成；降鈣素組和熏洗組軟骨損害較模模型組輕，軟骨表面欠光滑，個別區(qū)域顏色偏黯，可見見少量骨贅。與空白組比較，造模組關(guān)節(jié)軟骨破壞程度度嚴(yán)重（P＜0.05）；與模型組比較，降鈣素組和熏洗組組關(guān)節(jié)軟骨破壞較輕（P＜0.05）；而降鈣素組與熏洗組組比較，破壞程度無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3　各組兔關(guān)節(jié)軟骨退變JP評分比較（±s）

表3　各組兔關(guān)節(jié)軟骨退變JP評分比較（±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05（下同）

只數(shù)組別　評分空白組60模型組降鈣素組熏洗組6 6 6 2.83±0.75▲1.50±0.55▲*1.33±0.52▲*

4.2電鏡觀察結(jié)果

與空白組比較，模型組軟骨表面破損，裂隙四周可見大量細(xì)胞克隆現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量減少且排列無序，基質(zhì)染色非常不均，個別軟骨細(xì)胞核消失。熏洗組和降鈣素組關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度介于二者之間，即軟骨表面不規(guī)則，變薄、粗糙，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常、分布欠規(guī)則，基質(zhì)染色比較均勻。結(jié)果見表4、圖1。

表4　各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評分比較（±s）

表4　各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評分比較（±s）

組別　只數(shù)　評分6 0.56±0.07 6 6 6 7.1 3.9 4.0 7±0.20▲8±0.36▲* 8±0.21▲*空白組模型組降鈣素組熏洗組

圖1　各組兔關(guān)節(jié)軟骨電鏡圖（HE染色，×100）

4.3健步通絡(luò)絡(luò)熏蒸液對兔兔關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)節(jié)激酶1/2表達(dá)達(dá)的影響

模型組關(guān)節(jié)軟骨中ERK1/2 mRNA的表達(dá)明顯高于于空白組（P＜＜0.05）；與模型組比較，降鈣素組和熏洗洗組ERK1/2 mmRNA表達(dá)降低（P＜0.05），降鈣素組和和熏洗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表表5、圖2。

表5　各組兔關(guān)節(jié)軟骨ERK1/2 mRNA表達(dá)相對含量比較（±s）

表5　各組兔關(guān)節(jié)軟骨ERK1/2 mRNA表達(dá)相對含量比較（±s）

組別　只數(shù)　　E RK-1ERK-2 6　0.43±0.050.23±0.09 6　0.8 6　0.6 6　0.6 0±0.09▲5±0.06*▲0±0.08*▲0.72±0.01▲0.50±0.04*▲0.43±0.05*▲空白組模降熏型組鈣素組洗組

5　討論

健步通絡(luò)熏蒸液由伸筋草、制川烏、乳香、沒藥等等組成，具有舒舒筋活血、補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、活血消腫之功。其中伸筋草在《本草拾遺》中記載：“主人久患風(fēng)痹，腳膝疼冷，皮膚不仁，氣力衰弱。”現(xiàn)代藥理研究表明，伸筋草具有免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用，其復(fù)方制劑酊劑、乳膏劑均能治療關(guān)節(jié)炎等[4]。制川烏在《長沙藥解》中記載“其性疏利迅速，開通關(guān)腠，驅(qū)逐寒濕之力甚捷”。現(xiàn)代藥理研究表明，川烏有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤強(qiáng)心作用[5]。乳香、沒藥活血行氣止痛，現(xiàn)代藥理研究表明，二者配伍能抑制血小板聚集，增強(qiáng)活血化瘀的功效[6]。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，空白組較模型組ERK1/2 mRNA表達(dá)呈上升趨勢，提示ERK1/2參與OA關(guān)節(jié)軟骨的破壞。范氏等[7]亦發(fā)現(xiàn)，ERK參與軟骨細(xì)胞的增殖、分化及肥大，阻斷ERK通路可降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的破壞，抑制軟骨細(xì)胞的增殖，從而減輕軟骨損傷、鈣化和骨贅的形成，延緩病情的發(fā)展。本實(shí)驗采用健步通絡(luò)熏蒸液干預(yù)兔OA模型，發(fā)現(xiàn)其能抑制ERK1/2 mRNA表達(dá)，改善關(guān)節(jié)軟骨的損傷，延緩OA的病程進(jìn)展。但本實(shí)驗的樣本量少，難以保證實(shí)驗的可靠性，在以后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，提高實(shí)驗的科學(xué)性。OA發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，受多種信號通路的影響，而ERK1/2只是其中之一。

參考文獻(xiàn)：

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（修回日期：2015-04-27；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on Expression of ERK1/2 in Articular Cartilageof Rabbit Knee Osteoarthritis

LIU Hong-jie1, WANG Gang2(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Abstract:Objective To investigate the effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on the expression of extracellular signal-regulated kinase1/2 in articular cartilage of rabbit knee osteoarthritis; To discuss its related mechanism of action. Methods Six New Zealand white rabbits were randomly selected among 26 as blank group and 20 were made into osteoarthritis models by modified Hulth method. After four weeks, two rabbits were chosen to verify whether modeling was successful; 18 were randomly divided into model group, fumigation group and calcitonin group. The rabbits in model group and fumigation group were fumigated with water and Jianbu Tongluo Fumigation Fluid respectively, 30 min each time, 1 time a day. The rabbits in calcitonin group were treated with calcitonin intramuscular injection of 5 U/kg, 1 time a day. The treatment lasted twenty days. After twenty days, all rabbits were sacrificed through air embolism. The general configuration of articular cartilage was observed and PCR technique was used to detect the content of ERK1/2. Results Compared with the blank group, joint surface damage in the model group was more serious and the content of ERK1/2 increased. Joint surface damage in the fumigation group and calcitonin group was relative light, and the expression of ERK1/2 decreased in articular cartilage. Calcitonin group and fumigation group had no significant difference in joint surface damage and the expression of ERK1/2. Conclusion Jianbu Tongluo Fumigation Fluid can protect and inhibit the cartilage regression of knee osteoarthritis, and the mechanisms is associated with inhibition the expression of ERK1/2.

Key words:Jianbu Tongluo Fumigation Fluid; osteoarthritis; articular cartilage; extracellular signal-regulated kinase1/2; rabbits

收稿日期：（2015-03-24）

通訊作者：王鋼，E-mail：lhjtwq@163.com

基金項目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃（1212RJZA087）

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0063-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.018