免疫增強比濁法和免疫熒光法測定血漿和尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的比較及診斷膿毒癥急性腎損傷的價值

朱洪超，馬　娣，王　飛，張瑞雪，陸曉曄，朱長清

(1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 急診科，上海, 200127;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 外科ICU,

安徽 合肥, 230000;3.上海嘉定區中心醫院 急診科，上海, 201800)

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免疫增強比濁法和免疫熒光法測定血漿和尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的比較及診斷膿毒癥急性腎損傷的價值

朱洪超1，馬娣2，王飛3，張瑞雪1，陸曉曄1，朱長清1

(1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 急診科，上海, 200127;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 外科ICU,

安徽 合肥, 230000;3.上海嘉定區中心醫院 急診科，上海, 201800)

摘要:目的比較免疫增強比濁法和免疫熒光法在測定患者血漿和尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)的差異，評估血漿和尿液NGAL值對診斷膿毒癥患者發生急性腎損傷(AKI)的價值。方法選擇膿毒癥患者35例，根據是否發生AKI分為膿毒癥AKI組(n=12)和膿毒癥非AKI組(n=23)。另選取同期健康體檢人群8例作為對照組。留取入院24 h內的血漿和尿液標本。采用免疫增強比濁法和免疫熒光法分別測定血漿和尿液標本的NGAL值。繪制ROC曲線評估血漿NGAL值預測膿毒癥AKI的診斷效率。結果采用免疫增強比濁法進行測定，膿毒癥組血漿和尿NGAL值均顯著高于對照組 (P<0.01)。膿毒癥AKI組血漿NGAL顯著高于膿毒癥非AKI組(P<0.05)，但2組尿NGAL值差異無統計學意義(P>0.01)。采用免疫熒光法進行測定，膿毒癥組血漿NGAL值顯著高于對照組(P<0.01)，膿毒癥AKI組血漿NGAL值顯著高于膿毒癥非AKI組(P<0.05)。ROC分析表明，免疫增強比濁法曲線下面積0.785(95%CI：0.642～0.928)，免疫熒光法曲線下面積為0.853(95%CI：0.729～0.977)，約登指數最大時的判斷點分別為0.575和0.567。結論血漿NGAL值可判斷膿毒癥AKI的發生，免疫熒光法較免疫增強比濁法更為準確。

關鍵詞:膿毒癥; 急性腎損傷; 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白; 免疫增強比濁法; 免疫熒光法

膿毒癥(sepsis)是指由確定或者可疑感染引起的全身性炎癥反應綜合征。急性腎損傷(AKI)是一種由不同病因所致、具有不同臨床表現并以腎小球濾過率迅速下降為主要特點的臨床綜合征，臨床上危重癥患者發生急性腎損傷的情況很常見，而且死亡率較高，多中心大規模臨床試驗表明膿毒癥并發急性腎損傷患者的病死率為 44%，而未合并 AKI 的膿毒癥患者的病死率為 21%[1-2]。因此，早期預估膿毒癥患者發生AKI在臨床上顯得很重要。

目前臨床常用血肌酐(SCr)和尿量作為診斷 AKI 的指標存在一定缺陷，并不能敏感地指示出腎臟損傷的最初階段。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)是一個近幾年發展起來的腎損傷標志物，共價結合于中性粒細胞明膠酶，可在腎小管上皮受到損傷時表達顯著增加[3-4]。本研究探討了兩種測定方法對于測定血漿和尿液NGAL值的差異及評估血漿和尿液NGAL對于診斷膿毒癥患者發生急性腎損傷(AKI)的效力，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集入住上海交通大學附屬仁濟醫院急診科并已確診為膿毒癥的患者35例，其中男13例，女22例；住院期間12例發生AKI，設為膿毒癥AKI組；其余23例設為膿毒癥非AKI組。此外，另有8例同期健康體檢的成人設為對照組。所有患者診斷均符合《國際嚴重膿毒癥和膿毒癥休克治療指南(2012年修訂版)》[5]，膿毒癥AKI 診斷符合急性腎損傷的診斷和分級標準(RIFLE標準)。排除標準: ① 妊娠或哺乳期婦女; ② 年齡<18歲; ③ 慢性腎功能不全; ④ 免疫功能抑制及長期服用激素者。3組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。本研究獲得患者及家屬知情同意，通過了上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院倫理委員會批準。

表1　3組臨床資料比較

*注：血漿肌酐值為病人入院前后24 h內最高值

1.2方法

收集受試者入院24 h內的血液標本3 mL和尿液標本10 mL，離心后放于-80 ℃冰箱凍存。所用試劑及耗材為：中性粒細胞明膠酶相關脂質轉運蛋白測定試劑盒和NORMAN系列比濁分析儀(購自中國南京諾爾曼生物科技有限公司)、中性粒細胞明膠酶相關脂質轉運蛋白檢測試劑盒和TriageMeterPro熒光免疫分析儀(購自美國博適公司)。應用免疫增強比濁法測定血漿和尿液NGAL值，對同樣的血漿樣本，用免疫熒光法測定血漿NGAL值。對膿毒癥AKI組，膿毒癥非AKI組，對照組進行NGAL值組間比較，繪制ROC曲線。

免疫增強比濁法具體步驟如下：室溫下解凍樣本并充分混勻，加樣本12 μL于樣品反應杯中，然后加入240 μL試劑R1，等反應杯中散射光強度穩定后，加入60 μL試劑R2，在1～2 min內，測定散射光的變化率。免疫熒光法具體步驟如下：室溫下解凍樣本并充分混勻，在測試板上標記樣本編號并錄入配套儀器中，將樣本加入測試板孔中，在20～30 min內測定免疫熒光值。

1.3統計學處理

2結果

2.1免疫增強比濁法測定各組間血漿和尿液NGAL濃度比較

免疫增強比濁法測定血漿和尿液NGAL，顯示膿毒癥組血漿和尿NGAL值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。而且膿毒癥AKI組血漿NGAL高于膿毒癥非AKI組，差異有統計學意義(P<0.05)，但2組間尿NGAL值差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組免疫增強比濁法測定的血漿和尿液NGAL濃度比較

與對照組比較, **P<0.01; 與膿毒癥非AKI組比較, #P<0.05。

2.2免疫熒光法測定各組血漿NGAL濃度比較

免疫熒光法測定血漿NGAL, 膿毒癥組血漿NGAL值高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，膿毒癥AKI組血漿NGAL值高于膿毒癥非AKI組，差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

表3　各組免疫熒光法測定的血漿NGAL濃度比較

注：與對照組比較, **P<0.01;

與膿毒癥非AKI組比較, #P<0.05。

2.3兩種方法測定的血漿NGAL值預判AKI繪制ROC曲線

免疫增強比濁法預測AKI的曲線下面積是0.785，95%CI: 0.642～0.928,P<0.01。約登指數為0.575時，最佳截斷值是237.50，相應敏感度是0.833，特異度是0.742。免疫熒光法預測曲線下面積是0.853，95%CI: 0.729～0.977,P<0.01。約登指數是0.567時，最佳截斷值是215.50, 相應敏感度是0.667, 特異度是0.900(見圖1、2)。

圖1 免疫增強比濁法ROC曲線

圖2 免疫熒光法ROC曲線

3討論

近年來, AKI在急診危重癥患者中的發生率和死亡率逐漸升高，膿毒癥更是AKI發病的重要原因之一，嚴重影響了危重患者的生存，相應的醫療費用也逐漸增高[6-7]。因而深入分析AKI的流行病學特征，了解其相關特異性生物標志物，對于AKI的早期預防、診斷和挽救腎功能具有重要意義。目前在臨床上診斷AKI的主要指標有尿量、肌酐、尿素氮等。AKI的診斷標準主要靠血清肌酐(SCr)和尿量的變化，但是事實上, SCr并不是一個敏感的檢測指標，當SCr明顯升高的時候，腎小球功能已經受到了嚴重影響，尿量更容易被患者容量狀態和藥物等因素干擾[8-9]。NGAL是脂質運載蛋白家族成員，分子量為25 KD，共價鍵結合于中性粒細胞明膠酶，在人類許多組織中如腎臟、肺中呈低表達，在上皮細胞受到刺激后表達顯著增高。在缺血性、膿毒癥AKI以及腎移植術后均能在血液和尿液中檢測到NGAL大量增加[10]。 近年來對于NGAL的研究[11-12]主要集中于其與急性腎損害之間的相關性。損傷的腎小管上皮表達NGAL，誘導腎小管間質中浸潤的中性粒細胞發生凋亡，從而保護腎組織免于炎癥損害。研究[13-14]發現在心臟術后及放射性暴露等引起的急性腎損害者，其血漿及尿液中的NGAL可以作為AKI早期的一個標記。對于危重患者，膿毒癥及多發傷所致急性腎損害患者血漿中NGAL均明顯升高且與預后密切相關[15]。本研究也支持關于NGAL對急性腎損傷有早期指示作用的觀點。所有膿毒癥患者比健康對照組的血漿和尿液NGAL都高，膿毒癥伴有AKI比不伴有AKI的血漿和尿液NGAL顯著增高。

NGAL的檢測方法一開始是蛋白印記法，2005年丹麥的BioPorto公司首先推出酶聯免疫吸附測定商品試劑盒，可用于血和尿的NGAL檢測。該法采用雙抗體夾心法，敏感度高、線性范圍寬、特異性好及重復性高，但一般比較耗時，難以自動化進行，而且對標本保存條件要求高，容易受到細菌干擾，因而NGAL的檢測標準化會是將來研究的一個重點方向。本研究對比了免疫增強比濁法和免疫熒光法。結論顯示免疫熒光法(AUC=0.853)比免疫比濁法(AUC=0.785)ROC曲線下面積大，免疫增強比濁法靈敏度較高而免疫熒光法特異度較高，整體上比較，免疫熒光法更好。

本研究的不足在于樣本例數仍然偏少，沒有進行連續動態的NGAL檢測，免疫增強比濁法和免疫熒光法在臨床應用的比較結果，有待于大規模多中心的前瞻性臨床研究來進一步驗證。有相關研究提示尿液NGAL似乎比血漿NGAL更準確，但是在本次研究中，沒有發現這樣的結論，這方面有待進一步進行臨床研究評估。

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Comparison between immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence methodin detections of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in plasma and urine and their values in diagnosis of sepsis-induced acute kidney injury

ZHU Hongchao1, MA Di2, WANG Fei3, ZHANG Ruixue1,

LU Xiaoye1, ZHU Changqing1

(1.EmergencyDepartment,RenjiHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127; 2.ICU,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei,Anhui, 230000; 3.EmergencyDepartment,TheCentralHospitalofJiadingDistrictinShanghai,Shanghai, 201800)

ABSTRACT:ObjectiveTo compare the effect of immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence method in detections of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in plasma and urine and evaluate the value of NGAL in diagnosis of sepsis-induced acute kidney injury (AKI). MethodsAccording to the presence of AKI, 35 patients with sepsis were selected and divided into sepsis AKI group (n=12) and sepsis non-AKI group (n=23). Eight healthy people in the same period were selected as control group. The plasma and urine samples were collected. Immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence method were used to detect the value of NGAL in plasma and urine. ROC curves were drawn for evaluating the value of NGAL in plasma in predicting the diagnostic efficiency of AKI. ResultsFor the immune enhancement turbidimetry, the values of NGAL in plasma and urine in sepsis group were significantly higher than those in the control group (P<0.01). The value of NGAL in plasma in sepsis AKI group was significantly higher than that in the sepsis non-AKI group, but there was no significant difference in value of NGAL in urine between two groups (P>0.05). For the immumofluorescence method, the value of NGAL in plasma in sepsis group were significantly higher than that in the control group (P<0.01), and the value of NGAL in plasma in the sepsis AKI group was significantly higher than that in the sepsis non-AKI group (P<0.01). ROC curves showed that the area under the curve for immune enhancement turbidimetry was 0.785 (95%CI: 0.642～0.928), and the area under the curve for immumofluorescence method was 0.853 (95%CI: 0.729～0.977). The critical values of Youden index at maximum were 0.575 and 0.567. ConclusionThe value of NGAL in plasma can judge the occurrence of sepsis-induced AKI. Immumofluorescence method is more accurate than immune enhancement turbidimetry.

KEYWORDS:sepsis; acute kidney injury; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; immune enhancement turbidimetry; immumofluorescence method

通信作者:朱長清, E-mail: zhucq1965@126.com

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11523221)

收稿日期:2015-10-23

中圖分類號:R 692

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)03-032-04

DOI:10.7619/jcmp.201603010