豆豉纖溶酶研究進展

劉　雪濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南　250000

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豆豉纖溶酶研究進展

劉雪
濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南250000

摘要豆豉纖溶酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE）是豆豉中的發現的一種新型纖溶酶，在體外具有良好的溶栓作用。本文綜述了豆豉纖溶酶的溶栓機理、產生菌的篩選、酶學特性及基因的克隆表達等方面的進展，為進一步研究指明了方向。

關鍵詞豆豉纖溶酶；酶學性質；克隆表達

近年來血栓性疾病日益成為高發態勢，為人類健康帶來嚴重威脅，據統計，我國心臟病及腦中風的死亡率超過60%，而藥物溶栓是目前臨床最有效、應用最廣的治療手段。

日本學者須見洋行最早從納豆中提取到能溶解纖維蛋白的納豆激酶（NK），我國豆豉與日本納豆生產工藝相似，近年我國學者從豆豉中分離出產纖溶酶的枯草桿菌，將其所產纖溶酶命名為豆豉纖溶酶[1]（DFE），并對DFE的生產菌株、酶學性質、溶栓機制以及分子克隆表達等進行了研究[2]。

1　豆豉纖溶酶來源

豆豉纖溶酶主要來源于豆類發酵制品中的細菌，目前篩選出產DFE的菌株，主要有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌。1997年傅莉最早篩選到產纖溶酶活達200U/mL的枯草芽孢桿菌；之后多位學者篩選出產DFE活力較高的菌株，董明盛從豆豉中分離到DFE活性達683.3U/mL的枯草芽孢桿菌，魏靜分離到產纖溶酶活達452U/mL的凝結芽孢桿菌，彭勇等從豆豉中篩選到具有較高纖溶酶活的解淀粉芽孢桿菌，發酵液纖溶酶活力可達820U/mL。

2　豆豉纖溶酶溶栓機制

對DFE溶栓機制的研究，由于菌株來源不同，目前研究結果不盡相同，還有待進一步研究。研究方法為：同時在未處理和80℃熱處理過的纖維蛋白板上滴加酶液，檢測纖溶情況。若未加熱的板與加熱板的纖溶程度相同，顯示的僅是纖溶活性的作用，若未加熱的板纖溶程度高于加熱板，顯示存在纖溶活性和纖溶酶原激活活性兩種作用。王金英等研究了豆豉粗酶液，發現其同時存在直接纖溶和間接激活纖溶酶原活性兩種作用；彭勇等對解淀粉芽孢桿菌DC-4、劉柱對Bacillus sp. Nov及牛術敏等對枯草芽孢桿菌BS-26產的DFE的研究結果基本一致，在兩種纖維蛋白平板上的纖溶結果無明顯差異，顯示其僅是直接溶解纖維蛋白；通過動物血栓模型王成濤[3]對枯草桿菌 DC12-33發酵液中純化的纖溶酶的纖溶機制進行研究，結果酶對80℃加熱處理血凝塊的水解明顯慢于未經加熱組，說明它同時存在直接水解和激活纖溶酶原兩種纖溶機制。

3　豆豉纖溶酶性質

豆豉纖溶酶常通過磷酸鈣吸附、離子交換分離、丙酮沉淀、超濾脫鹽和凝膠過濾等方式進行純化和性質檢測。研究發現DFE是一種絲氨酸蛋白酶，pI為8～9，酶蛋白分子量為27kD～36kD，豆豉來源不同分子量有一定差異。彭勇通過SDS-PAGE檢測解淀粉芽孢桿菌DC-4產生的纖溶酶，發現無論上樣緩沖液中是否存在β-巰基乙醇，均呈現一條電泳條帶，證明豆豉纖溶酶為單鏈蛋白。

豆豉纖溶酶的熱穩定性和酸穩定性較弱，閻家麒等發現DFE在pH7～11范圍內穩定，而pH＜5時很快失活，但凍融對酶活性影響較小，-18℃反復凍融5次，酶活性損失小于5%。米坤研究了地衣芽孢桿菌產生的纖溶酶，分別在人工胃液和人工腸液中37℃放置3h，結果在人工胃液中殘余酶活約僅為17.6%，而在人工腸液中殘余酶活高于70%，應用中宜將其制成腸溶劑以保持其較高活力。為提高穩定性張嬋等采用硫酸銨梯度法制備了DFE納米脂質體，減少了在胃腸內的降解，為解決DFE口服生物利用度低等問題提供了新途徑。

4　豆豉纖溶酶基因工程改造

目前產纖溶酶的天然菌株普遍產酶量較低，為提高其產量，近年我國學者利用基因工程菌生產DFE，目前初步表達出活性DFE。最早彭勇[4]從解淀粉芽孢桿菌DC-4基因組中克隆到DFE成熟肽基因，將其構建成融合型表達載體pET-Nde，轉化大腸桿菌，誘導表達出無活性的包涵體融合蛋白。羅文華研究了基因自身啟動子的作用，擴增獲得DFE啟動子至3p非翻譯區的全長1400bp基因，通過大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pBE3，轉化到枯草桿菌WB800，加入自身啟動子后，重組菌獲得了高活性分泌表達，酶活高達690U/mL。王開敏等[5]對從豆豉的強纖溶活性的菌株擴增DFE基因，構建pYES2-DFE重組質粒，導入到釀酒酵母感受態細胞中，誘導表達后DFE活性達222.49U/mL，使DFE基因在真核生物中高活力的分泌表達。崔堂兵等采用定向進化技術對DFE基因進行定點突變，將第156位的谷氨酸、第166位的甘氨酸分別替換為絲氨酸和丙氨酸，第169位甘氨酸殘基替換為丙氨酸，并利用枯草芽孢桿菌WB800構建了表達菌株，3種表達菌株發酵上清液中纖溶酶的

活力性分別是原菌株活力的70%、115%和136%，為提高酶活力提供了一個新的有效途徑。

5　結論

依據目前研究成果，纖溶酶的活力產量難以應用與實際生產需要，通過誘變育種、優化發酵條件、基因工程技術等多種方式進一步提高酶活及產量變得非常關鍵。雖纖溶酶體外溶栓效果得到證實，但在體內的溶栓效果、毒副作用、最佳給藥方式等，還需要更進一步研究，也是DFE真正投入到臨床及市場前必須進行研究的重點。

參考文獻

[1]韓秋霞，鄒玉紅，崔志芳.一株高活性豆豉纖溶酶產生菌的篩選及其酶活的測定[J].中國釀造，2008，10：28-31.

[2]Shi H.Wang，Cheng Zhang， etal. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547[J]. World J Microbiol Biotechnol ，2008，24:475–482.

[3]王成濤，鄭杰，籍保平，等.豆豉纖溶酶Subtilisin FS33的溶栓作用及其機制的研究[J].營養學報，2007，29 （6）：600-604.

[4]彭勇，黃慶，張義正.枯草桿菌DC-2納豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表達[J].中國生物化學與分子生物學報，2002，18（5）：559-563.

[5]王開敏，趙敏.產纖溶酶菌株的分離和鑒定及纖溶酶基因在釀酒酵母中的表達[J].中國食品學報，2009，9（2）：23-28.

中圖分類號TS201.2

文獻標識碼A

文章編號1674-6708（2016）155-0143-01