香豆素類化合物清除自由基及抗腫瘤活性研究

張娜，陳文娟，柳青青，周玥，鐘儒剛（北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京100124）

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香豆素類化合物清除自由基及抗腫瘤活性研究

張娜，陳文娟，柳青青，周玥，鐘儒剛
（北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京100124）

摘要：運用電子順磁共振（EPR）和細胞增殖檢測試劑盒（MTS）兩種方法研究4個雙羥基香豆素化合物及天然產物VC的清除DPPH自由基及抗腫瘤細胞增殖的能力。結果表明，香豆素化合物清除DPPH自由基EC50值和抗腫瘤細胞增殖活性IC50值的范圍分別為9.04 μmol/L~37.32 μmol/L和21.76 μmol/L~38.48 μmol/L，均優于VC自由基清除能力（EC50為42.44μmol/L）和抗腫瘤細胞增殖能力（IC50為>100 μmol/L）。其中，化合物1a的清除自由能力最強（EC50為9.04 μmol/L），化合物2b的抗腫瘤活性最高（IC50為21.76 μmol/L）。因此，與VC相比，4個雙羥基類化合物表現出較強的自由基清除能力和抗腫瘤細胞增殖活性，為具有癌癥防治功能的天然產物抗氧化劑的開發利用提供理論基礎和試驗依據。

關鍵詞：香豆素；自由基清除能力；抗腫瘤活性；EPR；MTS

癌癥是當前嚴重威脅人類生命的最主要的疾病之一，而人體內過量的自由基可導致細胞和組織器官的損傷，進而誘發癌癥及心血管功能障礙等多種疾病[1-2]，攝入外源性的抗氧化劑可以在生理上和藥理水平上有效降低或預防癌癥的發生[3]。研究表明，作為抗氧化劑的天然產物如白藜蘆醇、大豆異黃酮和黃芩素可誘導癌細胞的死亡[4]。因此，兼具自由基清除活性且抗腫瘤活性的抗氧化劑成為癌癥防治的重要來源。

香豆素是一類廣泛分布于傘形科和蕓香科植物中的苯并呲喃酮衍生物，具有抗菌、消炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[5]，已被認定為重要的藥物先導化合物。相關文獻表明，香豆素類化合物通過控制血糖和血脂，抑制過氧自由基功效，抑制脂氧合酶和環氧合酶花生四烯酸的代謝途徑而發揮其抗氧化性功效[6-7]；同時，該類化合物在體內是一類重要的抗癌物質，對人類肺癌，腎癌及乳腺癌細胞線粒體具有顯著的抗增殖活性，也可通過抑制細胞中Cyclin D1的過量表達來抑制癌細胞增殖[8]。因此，香豆素所具有的多種藥理作用，如神經保護、抗腫瘤、抗炎作用等均與其抗氧化活性有關[9-10]。本研究選擇4-甲基及4-三氟甲基取代的雙羥基香豆素類化合物（如圖1所示），分別是來源于木犀科植物苦櫪白蠟樹的七葉亭（6，7-二羥基香豆素），及瑞香屬植物長白瑞香的瑞香素（7，8-二羥基香豆素）的衍生物，采用電子順磁共振方法（EPR）及細胞增殖試劑盒（MTS）測定化合物清除DPPH自由基的能力及抗腫瘤細胞增殖活性，以探究兩類化合物的清除自由基能力及抗腫瘤活性，為具有癌癥防治功能的天然產物抗氧化劑的開發利用提供理論基礎和試驗依據。

圖1香豆素化合物的化學結構式Fig.1 The chemical structure of coumarins

1材料與方法

1.1材料與儀器

6，7-二羥基-4-甲基香豆素（1a）、7，8-二羥基-4-甲基香豆素（1b）：百靈威公司；6，7-二羥基-4-三氟甲基香豆素（2a）、7，8-二羥基-4-三氟甲基香豆素（2b）：以1，2，4-苯三酚，1，2，3-苯三酚及三氟乙酰乙酸乙酯為原料：北京工業大學分析測試中心自制[11]；2，2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH）：美國Sigma公司；無水甲醇（一級色譜純）：天津四友精細化學品有限公司；MTS試劑盒：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；人肺癌細胞A549細胞株：上海華瑞生物科技有限公司。

A-300電子順磁共振儀：德國Bruker公司；EnSpire酶標儀：美國PerkinElmer公司。

1.2方法

1.2.1化合物溶液配置

香豆素溶液配制：分別準確稱取0.0096g化合物1a 與1b和0.0123g化合物2a與2b，使用無水甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成濃度為1 mmol/L儲備液。

VC溶液配制：準確稱取0.008 8 g VC，使用去離子水溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成濃度為1 mmol/L儲備液。使用去離子水將溶液稀釋為20、40、60、80、100、120、140 μmol/L的使用液。

DPPH溶液配制：準確稱取DPPH固體粉末0.071 0 g，用無水甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶，配制成1.80 mmol/L DPPH儲備液，冷藏避光保存。準確移取5 mL儲備液于50 mL容量瓶，用無水甲醇定容至刻度，配制成0.180 mmol/L DPPH使用液，使用液需現用現配。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定

使用無水甲醇將1 mmol/L儲備液稀釋為0、5、10、20、40、60、80、100 μmol/L的使用液。取不同濃度的香豆素化合物按照表1進行加樣，反應30 min后用50 μL毛細管吸取一定量反應混合液裝入保護管，置于諧振腔中進行測試[12]。EPR儀器所采用的參數為：中心磁場3 524.970 G；掃場寬度200.000 G；微波頻率9.842 GHz；微波功率20.17 mW；調制頻100 kHz；調制幅度2.00 G。以譜圖中3 507 G處峰高表示DPPH自由基的強度，按公式1計算化合物對DPPH自由基的清除率。

表1 EPR試驗加樣表Table 1 Sample composition for EPR experiment

式中：I1為未加化合物時DPPH原始信號強度，使用無水甲醇代替樣品液；I2為加入化合物后DPPH的信號強度。

1.2.3抗腫瘤細胞增殖活性測定

使用RPMI1640培養基將1 mmol/L儲備液稀釋為10、20、40、60、80、100、120、240 μmol/L的待測液。將處于對數生長期的肺癌細胞配成細胞懸液，以每孔7 500個細胞的量接種到96孔板內。在37℃，5 % CO2條件下孵育培養24 h，設置陰性對照3孔，將含有不同濃度的香豆素化合物的待測液處理A549細胞24 h。藥物作用24 h后，每孔加入10 μL MTS試劑，繼續培養2 h，終止培養，用酶標儀在450 nm波長下測定其吸光度值，并按公式2計算化合物對肺癌細胞A549的增殖抑制率繪制曲線。

式中：D1為未加待測物時的OD值，使用培養基代替樣品液；D2為加入待測物時的OD值。

2結果與分析

2.1香豆素化合物及VC清除DPPH自由基的能力

運用EPR方法對不同濃度的化合物及VC進行測試。以磁場強度為橫坐標，信號強度為縱坐標繪制化合物清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖。以化合物1a和VC為例，如圖2所示。

圖2不同濃度的化合物1a及VC清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖Fig.2 EPR signals of DPPH radicals scavenging for the different concentrations of compound 1a and VC

由圖2可知，DPPH自由基特征峰中心磁場均在3 507 G，自由基波譜信號強度均隨化合物濃度的增加而顯著減小，說明化合物的濃度越大對DPPH自由基的清除作用越強。進一步分析可知，化合物1a在濃度大于20 μmol/L后信號銳減，濃度為60 μmol/L時信號強度趨于零，說明化合物1a對DPPH自由基的清除能力較強。

香豆素化合物的清除自由基能力通過自由基清除率的EC50值體現，EC50值越小，則清除能力越高。以DPPH自由基清除率（%）對化合物濃度（μmol/L）作圖，見圖3。

圖3香豆素化合物及VC對DPPH自由基的清除率與濃度關系Fig.3 The correlation between DPPH radical scavenging rate and concentrations of coumarins and VC

由圖3可知，在一定濃度范圍內，DPPH自由基清除率隨濃度化合物的增加而逐漸升高。化合物1a與化合物1b，2a，2b分別在0~20 μmol/L和0~40 μmol/L內，清除率顯著升高，60 μmol/L的化合物1a與 80 μmol/L的化合物1b，2a，2b自由基清除效果相當，且清除率接近100 %。這與波譜圖的變化趨勢是一致的。結果通過計算得出：4種香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）及VC清除DPPH自由基的EC50值（DPPH起始強度減少50 %時所對應的清除劑濃度）分別為：9.04、37.32、34.60、29.33、42.44 μmol/L，清除能力依次為：化合物1a> 2b> 2a> 1b>VC。說明4種香豆素類化合物清除DPPH自由基的能力優于天然抗氧化劑VC。

2.2香豆素化合物及VC抑制A549細胞的增殖能力

運用MTS方法，對不同濃度的4個化合物及VC進行抗腫瘤細胞A549增殖活性測試。以增殖抑制率（%）對化合物濃度（μmol/L）作圖，見圖4。

圖4化合物對腫瘤細胞A549增殖的抑制率與濃度的關系Fig.4 The correlation between A549 cell proliferation inhibitory rate and concentrations of coumarins

由圖4可知，不同的香豆素衍生物作用于A549細胞24 h后，對A549細胞均有不同程度的抑制作用，且隨著香豆素衍生物濃度的增加，其增殖抑制率也在逐漸上升，說明化合物的濃度越大對A549細胞的增值抑制能力越強。進一步分析可知，不同化合物對A549細胞的抗增殖作用隨濃度變化趨勢不同，化合物1a、1b、2a的濃度到達100 μmol/L時，對A549細胞抗增值作用已經接近于80 %且趨于平緩；而只有化合物2b濃度為80 μmol/L/時其抑制率已經超過80 %，故化合物2b具有良好的抑制腫瘤細胞的作用。

香豆素化合物的抗腫瘤活性可通過增值抑制率的IC50值體現，抗腫瘤活性越高，IC50值越小。通過對比發現：4種香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）的抗腫瘤活性分別為：38.48、33.53、31.66、21.76 μmol/L；而VC的抗腫瘤活性>100 μmol/L，這與已報到的文獻相一致[13-14]。抗腫瘤活性的強弱依次為：化合物2b> 2a> 1b> 1a>VC；同時，吸電子基團CF3取代香豆素衍生物抗腫瘤細胞增值活性優于CH3取代香豆素衍生物。

3　結論

運用電子順磁共振和MTS兩種方法分別對香豆素化合物的自由基清除能力及抗腫瘤活性進行測定。試驗結果表明，雙羥基香豆素類化合物不僅對DPPH自由基具有較好的清除能力，而且對腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制活性，且均與香豆素的濃度呈正相關性。此試驗中的香豆素化合物清除DPPH自由基能力及抗腫瘤細胞增殖活性均優于VC，其中自由基清除能力最強為化合物1a（EC50=9.04 μmol/L），抗腫瘤活性最好的是化合物2b（IC50=21.76 μmol/L），該研究為具有癌癥防治功能的天然產物抗氧化劑的開發利用提供試驗依據。

總之，從天然植物中尋找天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業的發展趨勢，具有治療作用的天然抗氧化劑也將是現代醫藥、保健行業的發展方向。因此，基于天然植物，篩選和開發抗氧化作用確切、安全無毒的新品種或分離提取其有效抗氧化成分，并針對其抗氧化機理、協同作用、構效關系和分子設計等方面開展深入研究，將為天然抗氧化劑的應用開發奠定理論基礎和指導思路。

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Studies on Radical Scavenging and Anti-tumor Effects of Coumarins

ZHANG Na，CEHN Wen-juan，LIU Qing-qing，ZHOU Yue，ZHONG Ru-gang
（College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China）

Abstract：The free radical DPPH scavenging and anti-tumor activity of four dihydroxy coumarin derivatives and VCwere investigated using electron paramagnetic resonance（EPR）and MTS methods. The results showed that the ranges of EC50（radical scavenging ability）and IC50（antitumor activity）values of four compounds were 9.04 μmol/L-37.32 μmol/L and 21.76 μmol/L-38.48 μmol/L，respectively，and therefore the radical scavenging and anti-tumor ability of four compounds were more potential than those of VCwith EC50=42.44 μmol/L and IC50>100 μmol/L，respectively. Compound 1a（EC50=9.04 μmol/L）and 2b（IC50=21.76 μmol/L）were the most active compounds at DDPH radical scavenging and antitumor，respectively. In conclusion，compared with VC，four coumarin compounds exhibited more potential ability at radical scavenging and antitumor cell proliferation，and were considered as the natural antioxidant with free radical scavenging abilityand antitumor activity.

Key words：coumarins；radical scavenging ability；antitumor activity；EPR；MTS

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.001

作者簡介：張娜（1981—），女（漢），助理研究員，博士，研究方向：天然抗氧化劑研究與開發。

基金項目：國家自然科學基金（81402852）；北京市自然科學基金（7152013）；北京市教育委員會科技計劃（KM201610005031）