絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462000）

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絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺
（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462000）

摘要：觀察絲瓜提取物（Luffaextract，LE）對(duì)β-淀粉樣蛋白（Aβ25－35）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。應(yīng)用Aβ25－35造成神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)（MTT）比色法檢測(cè)各劑量組絲瓜提取物對(duì)PC12細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶（GSH-Px）活性水平，通過(guò)蛋白印跡試驗(yàn)（Western Blotting）來(lái)檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)水平。絲瓜提取物劑量組PC12細(xì)胞存活率高于模型組，GSHPx活性顯著增強(qiáng)，CAT含量顯著增加（P<0.01或P<0.05），Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)增高，與模型組比較，差異顯著（P<0.05～P<0.01）。絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：絲瓜提取物；PC12細(xì)胞；MTT檢測(cè)；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

老年性癡呆（Alzheimer’s disease，AD）的病理性特征是老年斑（senile plaque，SP），而SP的核心成分是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），正常生理情況，Aβ具有營(yíng)養(yǎng)因子的作用，但高濃度的長(zhǎng)鏈Aβ往往具有神經(jīng)毒性[1]，Aβ的產(chǎn)生、積聚增加是引起神經(jīng)元退化和死亡的主要機(jī)制。Aβ可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生過(guò)氧化物和自由基，從而加劇過(guò)氧化損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的傷害[2]。

絲瓜為葫蘆科植物，近年來(lái)證明絲瓜有增強(qiáng)免疫、抗應(yīng)激、抗病毒、促進(jìn)生長(zhǎng)等生理功能，能促進(jìn)記憶的獲得、鞏固和再現(xiàn)，有促智作用。絲瓜提取物有明顯抗氧化作用，用于美容可延緩衰老，廣泛用于洗滌日用品[3]。本研究將探討絲瓜提取物對(duì)β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）損傷PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，初步探討絲瓜提取物對(duì)AD的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

絲瓜提取物：西安森冉生物有限公司；PC12細(xì)胞：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；MTT、Aβ25-35：Sigma公司；CAT、GSH-Px檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清：杭州四季青工程材料研究所；Bcl-2、Bax抗體：SantaCruz生物技術(shù)公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器

UV-9200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水槽：寧波天恒儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱：Thermo公司；超凈工作臺(tái)：TBD生物儀器廠；EPOCH酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；凝膠掃描成像分析系統(tǒng)：美國(guó)startganee。

1.3 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及建立損傷模型

用含15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5 %CO2飽和濕度條件下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d～3 d換液1次，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，加入0.25 %胰蛋白酶消化，細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。離體培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為6組：空白組、模型組、絲瓜提取物高劑量組、絲瓜提取物中劑量組、絲瓜提取物低劑量組。模型組加入經(jīng)老化處理的Aβ25-35（終濃度為20 μmol/L）培育36 h，建立AD細(xì)胞模型，絲瓜提取物各劑量組分別用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）過(guò)夜培養(yǎng)共2 h后，再加入終濃度為20 μmol/LAβ25-35共同培養(yǎng)36 h，每組8孔，每孔200 μL。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞制成2×105個(gè)/mL懸液，置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行鋪板，每孔200 μL，分別給與不同處理因素作用24 h，MTT檢測(cè)時(shí)棄掉上清，再加入培養(yǎng)基180 μL，每孔再加MTT 20 μL，37℃培養(yǎng)4 h，然后吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩10 min后在酶標(biāo)儀于560 nm波長(zhǎng)處讀取標(biāo)本的吸光度，各組的吸光度與對(duì)照組的吸光度比值作為細(xì)胞的活力。按細(xì)胞相對(duì)活力計(jì)算公式：相對(duì)活力/%=[（處理組平均吸光度值－空白對(duì)照平均吸光度值）/（正常組平均吸光度值－空白對(duì)照組平均吸光度值）]×100。

1.5絲瓜提取物對(duì)氧化應(yīng)激的PC12細(xì)胞中抗氧化能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞制成2×105個(gè)/mL懸液并接種于6孔培養(yǎng)板。絲瓜提取物用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）預(yù)處理30 min，再加入終濃度為20μmol/LAβ25-35共同培養(yǎng)24h，完成給藥及Aβ25-35處理后，超聲破碎收集的細(xì)胞，4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞勻漿中CAT、GSH－Px活力。

1.6 Western blotting分析

加藥處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞并洗滌，SDSPAGE電泳分離總蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5 %的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉過(guò)的膜用TBST洗滌3次，將膜放入雜交袋內(nèi)，大鼠Bcl-2、Bax及β-actin-抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG 37℃孵育1 h，TBS漂洗，ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)分析掃描各條帶灰度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以X±S表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)法比較各組間差異，P＜0.05則認(rèn)為組間差異顯著。

2　結(jié)果

2.1絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)效果

與空白組相比，20 μmol/L的Aβ25-35處理后的細(xì)胞存活率明顯下降，僅為55.23 %，具有顯著差異性（P＜0.01）；當(dāng)PC12預(yù)先經(jīng)絲瓜提取物處理后再加Aβ25-35，細(xì)胞存活率顯著增加，并呈現(xiàn)劑量依耐性的趨勢(shì)，在絲瓜提取物（30.75、18.75、9.375 μg/mL）處理后細(xì)胞存活率分別能達(dá)到74.72 %、68.15 %及58.01 %。其中，9.375 μg/mL組與模型組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而絲瓜提取物30.75、18.75 μg/mL可以有效抑制Aβ25-35所致的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞生存率，與模型組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MTT檢測(cè)不同濃度的絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用Table 1 MTT test different concentrations of luffa extract protective effects on cytotoxicity of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-PX活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，絲瓜提取物各劑量組可顯著增加CAT、GSH-PX活性（P＜0.01，0.05）。且具有一定的劑量相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中CAT、GSH-PX的影響Table 2 Effect of luffa extract on CAT，GSH-PX of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.3絲瓜提取物對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)變化的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞模型組，Bax表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Bcl-2表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達(dá)比下降；與模型組比較，絲瓜提取物高、中、低劑量組Bax表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達(dá)水平的比值與模型組比較明顯上升。見(jiàn)表3和圖1。

表3絲瓜提取物對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)變化的影響Table 3 Effect of luffa extract on expression changes of Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25－35

1.空白組；2.模型組；3.LE低劑量組；4.LE中劑量組；5.LE高劑量組。圖1絲瓜提取物對(duì)Aβ25－35引起的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of luffa extract on protein expression induced by Aβ25-35

3　結(jié)論

近年來(lái)研究表明，人體隨年齡增長(zhǎng)所發(fā)生的退行性變化是細(xì)胞正常代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的過(guò)量自由基副作用的結(jié)果。如果機(jī)體CAT、GSH-PX等抗氧化酶等減少，將導(dǎo)致體內(nèi)自由基生成增加，加強(qiáng)過(guò)氧化反應(yīng)，使組織和細(xì)胞受到破壞，從而使組織功能下降，引起生物體衰老。本研究表明Aβ25-35引起PC12細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-PX等酶水平的降低，而PC12細(xì)胞經(jīng)絲瓜提取物預(yù)處理后，能明顯提高Aβ25－35抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-PX酶的水平，從而降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。減輕或阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化物作用，保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化氫物的損害，延緩細(xì)胞的衰老損傷，從而預(yù)防自由基導(dǎo)致的疾病的發(fā)生[4-5]。

Bcl家族中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡對(duì)細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡通路起著重要的作用，即Bc1-2/Bax的比值決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[6-7]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組Bc1-2蛋白表達(dá)反應(yīng)性降低，Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bc1-2/Bax的比值下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。經(jīng)絲瓜提取物干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制細(xì)胞凋亡，表明絲瓜提取物可抑制細(xì)胞凋亡。絲瓜提取物對(duì)AD小鼠腦神細(xì)胞的保護(hù)作用，可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，從而達(dá)到改善老年性癡呆的作用。

綜上，絲瓜提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有著明顯的保護(hù)作用，可能是通過(guò)增強(qiáng)PC12細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，但其防治AD的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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The Protective Effect of Luffa Extract on Injury of PC12 Cells Induced by Aβ25-35

LIU Chun-jie，DONG Li-min，ZHENG Ya-ping，KANG Hong-yu
（Luohe Medical College，Luohe 462000，Henan，China）

Abstract：To study the protective effect of luffa extract on injury of PC12 cells induced by amyloid β protein （Aβ25-35）. Neurons injury model was induced by Aβ25-35. MTT assay was used to detect the cellular viability after different concentrations of luffa extract. The activity of catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were detected. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blotting. Compared with the control group，the cellular viability of luffa extract group was increased，the activity of GSH -Px and CAT were significantly increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Bax was decreased and Bcl-2 was increased（P< 0.05-P<0.01）. luffa extract can protect PC12 cells from Aβ25-35induced cytotoxicity.

Key words：luffa extract；PC12 cells；MTT assay；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.006

作者簡(jiǎn)介：劉春杰（1971—），女（漢），副教授，研究生，研究方向：老年病及內(nèi)分泌藥理。

基金項(xiàng)目：河南省骨干教師資助課題（2011GGJS-281）；漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級(jí)科研課題（2014-S-LMC04）