蘋果多酚對Caco- 2細(xì)胞和LDL抗氧化作用的研究

張桂芝，籍保平，張迪（.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東中山58436；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京00083）

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蘋果多酚對Caco- 2細(xì)胞和LDL抗氧化作用的研究

張桂芝1，籍保平2，張迪2
（1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東中山528436；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

摘要：采用細(xì)胞氧化損傷模型和Cu2＋誘導(dǎo)的低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾模型來評價(jià)不同品種中蘋果多酚的抗氧化作用。結(jié)果表明H2O2濃度為10mmol/L時(shí)對細(xì)胞模型損傷程度比較適中。富士中蘋果多酚對損傷的Caco-2細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)，其中富士、國光、金冠和王林處理后細(xì)胞產(chǎn)MDA量分別是對照的20 %、33 %、40 %和60 %；蘋果多酚對LDL的氧化修飾具有顯著的抑制作用，除了王林多酚外，富士、國光和金冠均能極顯著地延長LDL氧化的延滯時(shí)間，其中富士蘋果多酚的作用最強(qiáng)是對照延滯階段時(shí)間的7倍，國光和金冠蘋果次之分別是對照延滯時(shí)間的4倍和3倍。

關(guān)鍵詞：蘋果多酚；Caco-2細(xì)胞；LDL氧化；抗氧化

近年來流行病學(xué)研究表明，食用蘋果和人類許多慢性疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。蘋果是多酚來源的一個(gè)重要原料。不同品種的蘋果其抗氧化活性不同。

目前天然抗氧化劑的實(shí)驗(yàn)篩選主要利用ESR和化學(xué)發(fā)光等技術(shù)[1]。化學(xué)評價(jià)體系具有快速、靈敏、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，但其主要缺點(diǎn)是無法模擬體內(nèi)的抗氧化效果，因此現(xiàn)在越來越多的國內(nèi)外研究者開始通過細(xì)胞體系來評價(jià)抗氧化成分對細(xì)胞的保護(hù)作用。Andrea等[2]發(fā)現(xiàn)在Caco-2細(xì)胞模型中有機(jī)柑橘汁相對于非有機(jī)柑橘汁表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力。Gunji[3]發(fā)現(xiàn)熱帶海藻提取物能夠提高過氧化氫處理的Caco-2的存活率。Kuo等[4]研究了黃酮類物質(zhì)對于腸癌細(xì)胞的抑制增殖作用、黃酮在Caco-2細(xì)胞中的積累和跨膜運(yùn)輸作用[5]、黃酮對Caco-2細(xì)胞中抗氧化蛋白的作用、黃酮結(jié)構(gòu)對于抑制Caco-2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響[6]。

當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧自由基時(shí)，血漿脂蛋白存在著明顯的氧化應(yīng)激，LDL極易轉(zhuǎn)化為氧化低密度脂蛋白（OX-LDL），它是動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[7]。因此本實(shí)驗(yàn)從抗氧化生物體系的角度選擇兩種不同的抗氧化評價(jià)模型，即細(xì)胞氧化損傷模型和Cu2＋離子誘導(dǎo)的LDL氧化修飾模型來評價(jià)蘋果多酚的抗氧化作用，為進(jìn)一步研究蘋果多酚的功能提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1細(xì)胞來源

Caco-2細(xì)胞來自ATCC：美國菌種保藏中心。

1.1.2蘋果多酚的制備[8]

以王林、富士、國光和金冠為原料。稱取約50 g預(yù)冷的蘋果加200 mL預(yù)冷的無水乙醇，打漿后浸提30 min，抽濾，然后于40℃旋蒸儀濃縮，濃縮液凍干備用。將蘋果多酚溶于PBS（pH為7.2）中，根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確定用于培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞的蘋果多酚終濃度為50 μg/mL。

1.1.3低密度脂蛋白

低密度脂蛋白（1.4 mg/mL）：購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心，用時(shí)以pH 7.4的PBS稀釋至250 μg/mL。

1.1.4試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS：Gibco公司；胰蛋白酶、MTT：Sigma分裝；二甲基亞砜：DMSO；MDA測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.5儀器

XDOS-1B倒置生物顯微鏡，HH.CP-01型二氧化碳培養(yǎng)箱，TDL-40B臺式離心機(jī)，Multiskan MK3型自動酶標(biāo)分析儀，WMV-1000微視攝像頭系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)與H2O2損傷

Caco-2細(xì)胞在含青鏈霉素和10 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，于37℃，5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80 %融合后，用0.25 %胰蛋白酶消化，以密度為5.0×104接種于96孔板中，培養(yǎng)7 d后（細(xì)胞密度約為107），用H2O2進(jìn)行損傷3 h。

1.2.2 MTT試驗(yàn)

將完成H2O2損傷的Caco-2細(xì)胞取出，棄去細(xì)胞上清液，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，然后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）和200 μL無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO震蕩20 min后于550 nm下處測定其吸光值。

1.2.3丙二醛（MDA）測定

將密度為5.0×104的細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)7 d后每孔用1 000 μL蘋果多酚作用24 h后，棄去細(xì)胞上清液，用PBS清洗細(xì)胞兩次，然后每孔加入10 mmol/L 的H2O2（按1∶1體積比溶于不完全培養(yǎng)基）1 000 μL損傷3 h，然后取細(xì)胞上清液于532 nm進(jìn)行MDA含量的測定。

MDA濃度計(jì)算公式：

1.2.4 Cu2+誘導(dǎo)的LDL的氧化方法[9]

在試管中分別加入250 μg/mL LDL 200 μL、200 μL樣品溶液、1 400 μL的PBS混勻放入37℃的水浴中預(yù)熱10 min。隨后加入200 μL的硫酸銅溶液使其最終濃度為2.5 μmol/L引發(fā)氧化反應(yīng)。其中，空白（不含Cu2+的LDL反應(yīng)體系）以PBS代替樣品溶液和硫酸銅溶液，對照以PBS代替樣品溶液。反應(yīng)引發(fā)后開始計(jì)時(shí)，每隔15 min于234 nm測定一次吸光值。本試驗(yàn)采取延滯時(shí)間來評估樣品對LDL氧化易感性的影響。延滯時(shí)間定義為氧化曲線的最大斜率與平行于x軸的初始吸光值軸的截距所得的時(shí)間。

2結(jié)果與分析

2.1 Caco-2細(xì)胞的H2O2損傷

H2O2對細(xì)胞損傷與濃度有關(guān)，本試驗(yàn)選取不同濃度的H2O2損傷細(xì)胞3 h后用MTT法測細(xì)胞活力其結(jié)果見表1。

表1 H2O2濃度對Caco-2細(xì)胞損傷的影響（n=6）Table 1 Effect of H2O2treatment on Caco-2 cells

從表1中可以看出隨著H2O2濃度的降低其對細(xì)胞損傷程度也減小，當(dāng)H2O2濃度為10 mmol/L時(shí)對細(xì)胞的損傷程度比較適中，因此后面試驗(yàn)選擇10 mmol/L為細(xì)胞損傷的濃度。

2.2細(xì)胞損傷丙二醛（MDA）測定

本試驗(yàn)采用提前給藥方式研究蘋果多酚對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出4種蘋果多酚處理比對照組的MDA顯著降低，說明蘋果中多酚能顯著降低細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷作用，其中富士、國光、金冠和王林處理后細(xì)胞產(chǎn)MDA量分別是對照的20 %、33 %、40 %和60%。因此富士蘋果多酚對細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)，國光和金冠次之，王林的作用較弱。

圖1蘋果多酚對H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響Fig.1 Effect of apple polyphenols on H2O2-induced oxidative stress in Caco-2 cells

2.3蘋果多酚抗低密度脂蛋白氧化作用

Cu2+氧化修飾LDL是通過Fenton反應(yīng)后生成的自由基作用于LDL中的PUFAS（多聚不飽和脂肪酸）PUFAS被氧化形成共軛雙烯于波長234 nm處有最大吸收峰。當(dāng)體系中含有外源的抗氧化劑時(shí)，會推遲延滯階段的出現(xiàn)，從圖2可以看出蘋果中的酚類物質(zhì)有效地推遲了LDL氧化修飾的啟動時(shí)間，說明蘋果多酚對LDL的氧化修飾具有抑制作用，此作用對防治心腦血管疾病具有尤其重要意義。

圖2蘋果多酚對Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化的影響Fig.2 Effect of apple polyphenols treatment on LDL oxidation by Cu2+

從延滯時(shí)間表2可以看出，與對照相比除了王林多酚外，富士、國光和金冠多酚均能顯著地延長LDL氧化的延滯時(shí)間，其中富士蘋果多酚的作用最強(qiáng)是對照延滯階段時(shí)間的7倍，國光和金冠蘋果次之分別為4倍和3倍。，

表2蘋果多酚對LDL氧化的延滯時(shí)間Table 2 Delay time of LDL oxidation by apple polyphenols

3　結(jié)論

結(jié)果表明蘋果多酚能有效清除H2O2誘導(dǎo)的活性氧自由基，避免Caco-2細(xì)胞損傷，并且對LDL的氧化修飾具有顯著的抑制作用，可以看出蘋果多酚能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多的活性氧自由基，阻斷體內(nèi)氧自由基的反應(yīng)鏈的LDL氧化修飾作用因此可能對防治心腦血管疾病將具有重要意義。

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Study on Antioxidant of Apple Polyphenols on Oxidative Stress Caco-2 Cellculture Mode and Oxidized Low Density Lipoproteins

ZHANG Gui-zhi1，JI Bao-ping2，ZHANG Di2
（1. Zhongshan Torch Polytechnic，Zhongshan 528436，Guangdong，China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract：The antioxidant and protective properties of apple polyphenols were investigated using oxidative stress Caco-2 cellculture mode and oxidized low density lipoproteins induced Cu2＋. The results showed that H2O2-induced oxidative stress was investigated using Caco-2 cells and 10 mmol/L H2O2was moderate. Apple polyphenols could protecte Caco-2 cells from oxidative stress. The MDA contents of cells were approximately 20 %，33 %，40 % and 60 % as in those of the control group for Fuji，Guoguang，Golden Delicious and Wanglin，respectively. The polyphenols of Fuji，Guoguang and Golden Deliciou apple could effectively prevent oxidation of LDL. The lag phages of LDL oxidation curves were prolonged over 7，4 and 3 times longer than that of the control group for Fuji，Guoguang and Golden Delicious，respectively.

Key words：apple polyphenols；Caco-2 cell；oxidized LDL；antioxidant

收稿日期：2014-07-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.011

作者簡介：張桂芝（1973—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品科學(xué)。