金銀花不同提取物抗氧化活性的研究

劉豪，張冬青，劉碩，馬淑紅，張艷玲，董阿力德爾圖，朝格圖（內蒙古大學化學化工學院，內蒙古呼和浩特010021）

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金銀花不同提取物抗氧化活性的研究

劉豪，張冬青，劉碩，馬淑紅，張艷玲*，董阿力德爾圖，朝格圖
（內蒙古大學化學化工學院，內蒙古呼和浩特010021）

摘要：初步研究金銀花不同提取物的抗氧化活性。將金銀花藥材用石油醚脫脂后，分別用無水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇和50%乙醇提取，采用紫外-可見分光光度法對不同溶劑提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量進行分析，并測試各提取物對羥基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除作用以對其抗氧化活性進行比較。結果表明：金銀花95%乙醇提取物綠原酸、總黃酮和總酚含量最高，分別為123.99、242.62和48.76 mg/g；95 %乙醇提取物清除·OH和DPPH·能力也最強，清除率分別為90.69 %和65.64 %。可見，金銀花清除·OH和DPPH·自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚的含量具有一定的相關性。

關鍵詞：金銀花；抗氧化活性；綠原酸；總黃酮；總酚；羥基自由基（·OH）；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，藥用歷史悠久，具有清熱解毒、疏散風熱的功能。現代藥理研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解熱、保肝、止血、降血脂、抗氧化、中樞興奮和免疫調節等功效[1-4]。金銀花含有揮發油、萜類、環烯醚萜苷類、三萜皂苷類、黃酮類、有機酸類、無機元素及其他等多種化學成分。2014年，國家衛生部《按照傳統既是食品又是中藥材物質目錄管理辦法》中明確了金銀花既是食品又是藥品，長期食用無毒副作用，它具有獨特的清香，悅鼻清心，滋味醇和，鮮爽回甘，是我國民間人們歷來非常喜愛而且重要的傳統保健飲品[5]。目前普遍認為綠原酸等有機酸類和黃酮類是金銀花的活性物質[6-12]。然而這些成分與抗氧化活性之間的相關性研究尚不深入。本文利用紫外-可見分光光度法對金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量以及清除羥基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）活性進行了分析，擬對金銀花活性成分與抗氧化活性的相關性進行探討，為該藥食同源品種的深入研究提供數據參考和試驗支撐。

1材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花藥材（產地河南）：購自亳州市京皖中藥飲片廠，經鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花；石油醚（b.p. 60℃~ 90℃）、乙醇、95 %乙醇、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水：天津市北聯精細化學品開發有限公司，均為分析純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純；DPPH（≥96 %）、焦性沒食子酸（分析純）、鄰二氮菲：上海晶純生化科技股份有限公司；蘆丁標準品（HPLC≥98%）：北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

U-3900H紫外可見分光光度計：日本日立公司；RE-52旋轉蒸發儀：上海亞榮；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鞏義予華；DZF-6090真空干燥箱：上海一恒；MILLI-Q DIRECT 8超純水器：美國Millipore；VFD-1000冷凍干燥機：北京博醫康；FA1004分析天平：上海精天；pH計：上海奧豪斯；DF-101XP集熱式水浴鍋：金壇市正基。

1.3方法

1.3.1金銀花的提取

將干燥金銀花粉碎，各稱取25 g，經石油醚脫脂后，分別用無水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80 %乙醇、70 %乙醇、60 %乙醇和50 %乙醇超聲輔助提取0.5 h，各3次，將各提取液過濾、減壓濃縮并冷凍干燥后得到各提取物。

1.3.2綠原酸含量的測定

參考文獻[13]，稱取綠原酸標準品0.010 0 g，配成1 g/L的溶液。分別準確吸取綠原酸標準品0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL于已編號的10 mL比色管內，用60 %乙醇稀釋到刻度。各標準品濃度為5、10、15、20、25、30 mg/L，以60 %乙醇為參比，在波長為328.5 nm處測定吸光度。以A為縱坐標，c為橫坐標繪制標準曲線。將待測樣品用60 %乙醇配制成50 mg/L溶液后測定。以60 %乙醇為參比溶液，在328.5 nm處測定吸光度。 [14-16]，以蘆丁作對照品，測定金銀花不同提取物的總黃酮含量。準確吸取60 %乙醇配置濃度為0.6 mg/mL的蘆丁標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管內，分別加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60 %乙醇溶液；再加入5 %亞硝酸鈉溶液0.5 mL搖勻，放置6 min；加入10 %硝酸鋁溶液0.5 mL，放置6 min；加入4 %氫氧化鈉溶液4.0 mL，加60 %乙醇定容到10 mL，搖勻后，放置15min；掃描找到最大吸收波長為505 nm，在此波長處測定吸光度。用0.0 mL作為空白，用蘆丁含量的濃度作為橫坐標，縱坐標為一定濃度下所對應的吸光度，作標準曲線。金銀花不同提取物分別配制成1 g/L溶液后同法測定，將其吸光度值代入上述標準曲線方程得到金銀花不同提取物中黃酮的含量。試驗重復3次。測定結果見表2。 [17-18]，以焦性沒食子酸作對照品，采用Folin-ciocalteu法測定金銀花不同提取物的總酚含量。精確吸取濃度為0.020 mg/mL的焦性沒食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分別置于10 mL比色管中，都加入5 mL去離子水、0.5 mL的Folinciocalteu試劑，1 min后加入1.5 mL濃度為75.0 mg/mL 的Na2CO3溶液，去離子水定容至刻度，搖勻，75℃水浴反應10 min。在最大吸收波長767 nm處測定吸光度。用0.00 mL作為空白，用焦性沒食子酸含量的濃度作為橫坐標，縱坐標作為一定濃度下所對應的吸光度，作標準曲線。金銀花不同提取物按1.3.3配制后同法測定，將其吸光度值代入上述標準曲線方程得到金銀花不同提取物中總酚的含量。試驗重復3次。

1.3.3總黃酮含量的測定

1.3.4總酚含量的測定

1.3.5對·OH自由基清除作用的測定

將金銀花不同溶劑提取物用60 %乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去離子水配成0.1g/L的溶液。參考文獻[19]的方法，精確移取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液0.5 mL，pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL和雙蒸水0.5 mL，搖勻，再加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵0.5 mL，搖勻，最后再加入0.01 %過氧化氫溶液0.5 mL，37℃恒溫水浴60 min，在509.5 nm處測定其吸光度，記作A損；另一比色管中用0.5 mL雙蒸水代替0.5 mL過氧化氫，測定其吸光度，記作A未；再在一比色管中用不同濃度梯度的VC對照溶液或金銀花不同溶劑提取物樣品溶液代替0.5 mL雙蒸水，以雙蒸水為空白。在509.5nm處測其吸光度，記作A樣。平行測定3次，記錄吸光度，計算不同濃度VC對照溶液或金銀花不同溶劑提取物樣品溶液對羥基自由基的清除率。

1.3.6對DPPH·自由基清除作用的測定

金銀花不同提取物與VC按1.3.5配制。參考文獻[19-20]的方法，DPPH用60 %乙醇配成65 μmol/L溶液，加樣于具塞比色管中，搖勻反應30 min后，用紫外-可見分光光度計于520 nm（DPPH最大吸收波長）處測定吸光度（60 %乙醇溶液為參比）。1.5mL65μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60 %乙醇溶液的吸光度記為A0，1.5mL65μmol/LDPPH溶液加入1.5mL樣品溶液的吸光度記為Ai，1.5mL60%乙醇溶液加入1.5mL樣品溶液的吸光度記為Aj。取3次試驗的平均值計算清除率。

2結果與分析

2.1金銀花不同提取物的提取率

金銀花不同提取物的提取率見表1。

表1金銀花不同溶劑提取物的提取率Table 1 Extract yield of the flower buds of Lonicera japonica by different solvents

由表1可知，金銀花60 %乙醇提取物得率最高，為27.41 %。

2.2金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮、總酚含量

采用吸光值外標法計算出金銀花不同溶劑提取物中的綠原酸、總黃酮、總酚含量，結果見表2。

表2金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量Table 2 Contents of total flavonoids，total phenols and lutein of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica

綠原酸標準品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.073 52x-0.004 5（R2= 0.999 6）。經分析比較可知，金銀花各提取物中綠原酸含量的高低順序為：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>無水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。

蘆丁標準品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.015 77x - 0.011 62（R2= 0.999 7）。經分析比較可知，金銀花各提取物中總黃酮含量的高低順序為：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無水乙醇提取物。

焦性沒食子酸標準品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.151 4x - 0.086 78（R2= 0.990 7）。經分析比較可知，金銀花各提取物中總酚含量的高低順序為：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無水乙醇提取物。

2.3金銀花不同提取物對·OH的清除作用

金銀花不同提取物和VC對·OH的清除作用見表3。

表3金銀花不同提取物和VC對·OH的清除作用Table 3·OH scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

利用鄰二氮菲法，測得金銀花不同提取物對羥基自由基的清除能力由大到小依次為：VC>95 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無水乙醇提取物>70 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %乙醇提取物的清除能力最強，清除率為90.69 %；而50 %乙醇提取物的清除能力最弱，清除率為30.53 %。

2.4金銀花不同提取物對DPPH·的清除作用

金銀花不同提取物和VC對DPPH·的清除作用見表4。

表4金銀花不同提取物和VC對DPPH·的清除作用Table 4 DPPH·scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

由表4可知，金銀花不同溶劑提取物對DPPH·的清除能力依次為：VC>95 %乙醇提取物>無水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %和無水乙醇提取物清除DPPH·的能力是最強的，清除率分別為65.64 %和63.90 %；而70 %乙醇提取物的清除能力是最弱的，為38.55 %。

3　結論

上述研究發現，金銀花各提取物中綠原酸、黃酮和多酚含量較高的前三位分別依次是95 %乙醇提取物、60 %乙醇提取物、50 %乙醇提取物，而且綠原酸、黃酮和多酚含量的大小順序完全一致；其中，金銀花95 %乙醇提取物的綠原酸、黃酮和多酚含量最高，其清除OH·和DPPH·自由基的能力也最強。可見，金銀花95 %乙醇提取物具有最佳的抗氧化活性。金銀花清除OH·和DPPH·自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚含量具有一定的相關性，但是并不呈線性的正相關性。金銀花除含有綠原酸、黃酮和多酚，還含有揮發油、萜類、環烯醚萜苷類、三萜皂苷類、有機酸類、無機元素等多種化學成分，其抗氧化活性是其中所含有多種成分綜合作用的結果。除綠原酸、黃酮和多酚外，金銀花中可能還含有其他具有抗氧化活性的化學成分。因此，金銀花95 %乙醇提取物具體都含有哪些抗氧化活性成分，其抗氧化能力有何不同，作用機理有何區別，各個成分之間有無協同作用，這些都有待進一步深入研究。

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Study on the Antioxidant Activity of Different Extracts of the Flower Buds of Lonicera japonica

LIU Hao，ZHANG Dong-qing，LIU Shuo，MA Shu-hong，ZHANG Yan-ling*，DONG Alideertu，Tsogt
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，Inner Mongolia，China）

Abstract：The antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica was studied preliminarily in this paper. After extraction by petroleum ether，100 % ethanol，95 % ethanol，90 % ethanol，80 % ethanol，70 % ethanol，60 % ethanol and 50 % ethanol was used to extract the flower buds of Lonicera japonica. The ultraviolet-visible spectrophotometry was applied to test the contents of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols. To compare the antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica，·OH and DPPH·free radical scavenging ability were measured as well. The results showed that 95 % ethanol extract had highest content of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols，that was 123.99 mg/g，242.62 mg/g and 48.76 mg/g；95 % ethanol extract had the strongest·OH and DPPH·radical scavenging ability with scavenging ratio of 90.69 % and 65.64 %. Thus，·OH and DPPH·scavenging capacity presented probably positive relatively with concentration of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols.

Key words：the flower buds of Lonicera japonica；antioxidant bioactivity；chlorogenic acid；total flavonoids；total polyphenols；hydroxyl radical（·OH）；diphenyl picryl hydrazinyl radical（DPPH·）

收稿日期：2015-09-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.013

*通信作者

作者簡介：劉豪（1995—），男（漢），本科生，研究方向：分析化學。

基金項目：國家自然科學基金地區項目（31160332）；內蒙古自治區高等學校科學技術研究項目（NJZZ13015）；內蒙古大學高層次人才引進科研啟動項目（Z20100108）