響應面法優化酶解提取花生根莖中白藜蘆醇

王月珍，汪巖，馬千里，劉志紅，牛艷秋（長春醫學高等專科學校，吉林長春130031）

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響應面法優化酶解提取花生根莖中白藜蘆醇

王月珍，汪巖，馬千里，劉志紅，牛艷秋
（長春醫學高等專科學校，吉林長春130031）

摘要：對酶解法提取花生根莖中的白藜蘆醇工藝進行研究，確定最佳酶解提取工藝。以纖維素酶用量、酶解時間、料液比為自變量，以白藜蘆醇提取率為因變量，通過對自變量的不同水平進行多元線性回歸及二項式擬合，采用星點設計-響應面法優化白藜蘆醇提取工藝，并進行預測分析。結果表明：酶解法提取花生中白藜蘆醇的最佳工藝為：纖維素酶用量50mg/g，酶解時間20h，料液比1∶12（g/mL）。

關鍵詞：花生；纖維素酶酶解；星點設計-響應面法；白藜蘆醇

花生又稱落花生、番果和長壽果，為一年生草本植物，來源于豆科[1]。在我國，花生年產量約12 000 kt[2]高居世界第二。花生多以其種子食用，其根、莖、葉多被廢棄在田間地頭，或者被作為牲畜的草料和生活柴草，從而造成資源的極大浪費。現代藥學研究表明：白藜蘆醇在花生根中含量最高，花生莖中次之，其后依次為花生紅衣和花生仁[3]，可見花生根、莖是提取白藜蘆醇的天然植物資源。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）又稱芪三酚，是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚類化合物，于1939年首次從毛葉藜蘆植物中提取得到，1976年Ingham首次從花生中分離得到該物質。隨著研究的深入，發現該成分具有抗癌、抗病毒、抗氧化、抗誘變、保肝、抑菌及降血脂等功效[4]，所以在食品、藥品、保健品中的應用廣泛，隨著市場需求的不斷加大，建立一套行之有效的白藜蘆醇提取工藝開始被人們所關注。目前，白藜蘆醇的提取方法有多種[5]，王鳳舞等用纖維素酶酶解法提取花生紅衣中白藜蘆醇[6]，其中因其高效性而成為該提取工藝的研究重點，雖比傳統工藝優越很多，但因纖維素酶的不穩定性及周圍環境的復雜性，在進行酶解提取后，白藜蘆醇提取率卻是千差萬別，重復性較差。并且酶解法提取花生根、莖中白藜蘆醇鮮見報道，故本研究采用酶解法進行白藜蘆醇的提取工藝研究，以花生根、莖為原料，采用星點設計-響應面法優化白藜蘆醇的提取工藝，從而建立花生根、莖的白藜蘆醇最佳提取工藝，為白藜蘆醇的規模化提取及拓寬白藜蘆醇提取的植物來源提供科學的參考。

1　材料

Agilent 1100高效液相色譜儀、DAD檢測器、Agilent色譜工作站：美國安捷倫；KQ2200E型超聲清洗機：中國昆山儀器有限公司；ALC211014電子天平：國華電器有限公司；電熱真空干燥箱：上海精宏；WK-4008高速中藥粉碎機：青州市精誠機械有限公司。

白藜蘆醇對照品：由中國藥品生物制品檢定所提供（批號111535-200502）；花生（四粒紅）根、莖：采自吉林省樺甸市靖宇縣，經鑒定為豆科植物落花生屬花生的干燥根和莖；纖維素酶（1 000 U/g）：上海紫一試劑廠；提取用乙醇為分析純，水為蒸餾水；HPLC含量測定用乙腈為色譜純，水為超純水；處理供試品和對照品用試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1白藜蘆醇的含量測定

2.1.1色譜條件

色譜柱：大連伊利特分析儀器有限公司產4.6 mm× 250 mm，5 μm C18柱；流動相：乙腈-水（40：60，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：303 nm。2.1.2對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的白藜蘆醇對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加適量乙腈定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3供試品溶液制備

稱取花生根、莖提取物10 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中加乙腈定容至刻度，超聲5 min，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4標準曲線繪制

精密吸取白藜蘆醇對照品溶液分別稀釋成100、200、300、400、500 μg/mL的溶液，依次進樣，按2.1.1項下的色譜條件測定。以濃度（Y）為縱坐標，峰面積（X）為橫坐標，繪制標準曲線，并得回歸方程：Y= 35.148 X-0.73，r=0.999 7。表明白藜蘆醇在100 μg/mL～500 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度試驗

按照“2.1.1”項下的色譜條件試驗，取同一濃度的白藜蘆醇對照品溶液，連續進樣5次，測定峰面積積分值，計算精密度。RSD為2.6 %，表明精密度良好。

2.1.6穩定性試驗

取同一樣品溶液，分別在0.5、1、4、8、12 h測含量，結果樣品在12 h內基本穩定，RSD為2.9 %。

2.1.7重復性試驗

精密稱取同一批花生根、莖提取物的粉末5份，每份0.1 g，按“2.1.3”項下方法制備和“2.1.1”項下色譜條件進行測定，RSD為3.2 %。

2.1.8加樣回收率

精密稱取己知白藜蘆醇含量的花生提取物粉末5份，每份0.05 g精密加入白藜蘆醇儲備液0.1 mL，按“2.1.3”項下方法制備和“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率。白藜蘆醇的平均回收率為99.8 %，RSD為3.2 %。

2.1.9含量測定

按照2.1.3所述方法將試驗中各樣品制成供試品，分別取過0.45 μm微孔濾膜的各供試液續濾液10 μL注入高效液相色譜儀，測定各組白藜蘆醇的含量，計算白藜蘆醇提取率。

2.2白藜蘆醇提取工藝優化

2.2.1單因素試驗

根據報道[7]可知白藜蘆醇對光熱敏感易分解，會影響其提取率，故在試驗時注意保持在室溫下避光酶解，選取纖維素酶添加量（10、30、50 mg/g）、酶解時間（6、18、30 h）、料液比[1∶4、1∶8、1∶12（g/mL）]作為考察因素，觀察其對花生根莖中白藜蘆醇提取率的影響，結果白藜蘆醇提取率分別為0.82 %、0.97 %、0.89 %、0.94 %、1.03 %、0.98 %、0.87 %、0.99 %、1.07 %。說明3個因素均為影響白藜蘆醇提取率的主要因素。

2.2.2星點設計-響應面法優化工藝

根據2.2.1的試驗結果，采用星點設計-響應面法建立試驗模型，以主要影響因素為自變量，白藜蘆醇提取率為因變量，每個因素設計5個水平，分別為：-α，-1，0，1，α，其中α=1.628。因素水平見表1；試驗星點設計及結果見表2。

表1白藜蘆醇的提取工藝星點試驗因素水平Table 1 The extraction process of resveratrol for factor levels

表2白藜蘆醇的提取工藝星點試驗安排Table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

續表2白藜蘆醇的提取工藝星點試驗安排Continue table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

根據表2的數據，運用Design-Expert.8.05軟件分析響應面，以白藜蘆醇提取率（Y）為響應值分別對各因素進行多元線性回歸二項式方程擬合，擬合模型為：Y =1.02 +0.13A +8.32B +0.05C +2.50AB +0.02AC + 5.00BC+0.04A2+3.36B2+0.02C2（R2=0.955 0），對模型采用F檢驗進行方差分析，結果見表3。

表3白藜蘆醇提取率星點設計F檢驗方差分析Table 3 The resveratrol extraction yield design for F test of variance analysis

由方差分析表可知，所選取的因素對白藜蘆醇提取率的影響為：A>C>B，即加酶量對提取率的影響最為顯著，其次為提取溶劑用量和酶解時間。提取率與提取各因素之間關系見圖1。

運用Design-Expert.8.05軟件對二項式回歸模型進行預測分析，得到的白藜蘆醇最佳提取工藝為：酶添加量50 mg/g，酶解時間30 h，料液比1∶12（g/mL），此時預測得到白藜蘆醇的提取率為1.28 %。按所得到的最佳工藝進行3次驗證性試驗，結果顯示白藜蘆醇的提取率平均值為1.25 %，與預測值的偏差為0.03 %，且試驗重現性較好。但考慮實際的操作性，建議對影響因素較小的酶解時間進行合理控制，最后確定最佳提取工藝為：酶添加量50 mg/g，酶解時間20 h，料液比1∶12（g/mL）。

圖1各因素對花生根、莖白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 The factors of the effects that extraction yield of resveratrol from the root and stalk of the peanut注：a為酶添加量與料液比的交互作用；b為酶添加量與酶解時間的交互作用；c為酶解時間與料液比的交互作用。

3　討論

1）研究結果表明，優化后的工藝條件明顯改善了原有的酶解法所存在的提取率不穩定、提取時間不確定及提取劑浪費等問題，優化后的提取工藝使提取率保持在1.25 %以上，且提取效果穩定，重現性好，避免了試劑與提取時間的浪費。

2）試驗過程中避光和室溫的選擇也為以后花生根、莖中的白藜蘆醇的工業規模化提取提供了一定的現實數據支撐，保證了工藝實施推廣的可行性。

3）目前，我國白藜蘆醇的提取原料主要來自于葡萄、虎杖等植物。花生根、莖中白藜蘆醇提取工藝的建立擴大了白藜蘆醇提取原料的取材范圍，使花生植物物盡其用，提升了花生植物資源的經濟價值，為農民創收的同時避免了資源的嚴重浪費，減少了農作物秸稈的季節性燃燒，為進一步提升空氣質量起到了一定的積極作用。

參考文獻：

[1]姜燕,鮑慧娟,張海悅.花生紅衣白藜蘆醇的研究進展[J].食品研究與開發,2013,34(18):129-132

[2]趙海峰,魏強,于秀妍.我國花生生產現狀及增產措施[J].農業科技與裝備,2009(2):81-82

[3]張烜,胡君萍,韓玫,等.HPLC法測定花生不同部位中白藜蘆醇的含量[J].新疆醫科大學學報,2003,26(5):440-441

[4]程建蕊,王振月,胡鳳,等.白藜蘆醇在植物中的分布及其生物活性研究進展[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2007,9(5):91-96

[5]王琴飛,李景明,張如蓮.花生中白藜蘆醇及其衍生物的研究進展[J].中國糧油學報,2009,24(10):145-152

[6]王鳳舞,李鵬,樸美子.纖維素酶法提取花生紅衣中的白藜蘆醇[J].中國食品學報,2009,9(5):76-80

[7]曹庸,于華忠,張敏,等.HPLC法測定虎杖白藜蘆醇的含量及其穩定性研究[J].林產化學與工業,2004,24(2):61-64

Optimize for Enzymatic Hydrolysis Extraction of Resveratrol from Peanut Rhizoma by Central Composite Design and Response Surface Methodology

WANG Yue-zhen，WANG Yan，MA Qian-li，LIU Zhi-hong，NIU Yan-qiu
（Changchun Medical Collage，Changchun 130031，Jilin，China）

Abstract：To make sure the best enzymolysis extraction process，enzymatic hydrolysis extraction of resveratrol from peanut rhizoma was investigated. Taking cellulose dosage，emzymolysis time and solid-liquid ratio as independent variables，overall extraction of resveratrol from peanut rhizoma as dependent variable，each level of

independent variables was fitted by multiple linear regression and binomial formula fitting，extraction prosess was optimized by response surface method，and prediction was carried out through comparing the observed and predicted value.The results showed that the optimum conditions for enzymolysis were：cellulose dosage 50 mg/g，20 h for enzymolysis and solid-liquid ratio 1∶12（g/mL）.

Key words：peanut；cellulose degradation；CCD；resveratrol

收稿日期：2015-09-11

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.031

作者簡介：王月珍（1978—），女（漢），講師，碩士，研究方向：中藥學、藥用資源質量評價。