核桃多肽的制備及其體外抗氧化性研究

顏小捷，蔣周田，2，楊子明，鄭立浪，3，李典鵬，*（.廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室廣西植物研究所，廣西桂林54006；2.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林54006；3.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林54004）

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核桃多肽的制備及其體外抗氧化性研究

顏小捷1，蔣周田1，2，楊子明1，鄭立浪1，3，李典鵬1，*
（1.廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室廣西植物研究所，廣西桂林541006；2.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541006；3.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541004）

摘要：以核桃蛋白為原料，以水解度為指標，通過單因素和正交試驗優化了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白制備抗氧化肽的工藝參數。得到堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量5 %，底物濃度3 %，酶解溫度55℃，酶解pH為9.0，酶解時間6 h；在各酶最佳條件下獲得的核桃多肽具有一定的抗氧化性。

關鍵詞：堿性蛋白酶；核桃蛋白；酶解；抗氧化

我國核桃資源非常豐富，已有研究表明，核桃油具有顯著降血脂和降動脈粥樣硬化危險性的作用，而大量核桃仁榨油后的產物即核桃餅粕常被作為飲料或肥料，甚至作為廢棄物被丟棄[1-2]。研究表明核桃餅粕能明顯提高大鼠學習和記憶能力，改善大鼠的抗氧化功能，提高乙酰膽堿酯酶的活性，其分離蛋白酶解產物具有較強的血管緊張素轉化酶（ACE）抑制率[3-4]。有一定的溶血性和抑菌作用。近年來，對核桃餅粕的深加工已逐步開展起來，主要是利用核桃餅粕制備核桃多肽[5]。

核桃蛋白酶解產物的水解度及其抗氧化活性受不同酶解方式的影響[6-8]。為了充分開發利用核桃蛋白，對其進行了多種酶酶解研究。課題組前期研究表明：木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的最佳酶解條件為：酶添加量5 %、底物濃度4 %、酶解pH為7.0、酶解溫度50℃、酶解時間4 h；在該條件下，木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白水解度可高于25.76 %；植物蛋白水解專用酶1（以下簡稱：酶1）最佳酶解條件：酶添加量為0.5 %，底物濃度為11 %，酶解溫度為55℃，酶解時的pH為10.0，酶解時間為12 h；植物蛋白水解專用酶2（以下簡稱：酶2）最佳酶解條件：酶添加量為0.5 %，底物濃度為12 %，酶解溫度為50℃，酶解時的pH為9.0，酶解時間為14 h。在前期研究基礎上，本研究同時考察了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝參數，并進一步考察了上述4種酶在最佳條件下酶解產物的體內外抗氧化性研究。研究結果可為核桃多肽的制備及應用提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

核桃餅粕：購自青島十相自在食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活為200萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限責任公司；木瓜蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；酶1、酶2（酶活均為30～40萬U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；鹽酸、氫氧化鈉、茚三酮、乙醇：西隴化工股份有限公司；DPPH：sigma公司；ABTS：南京奧多福尼生物科技有限公司；過硫酸鉀、甘氨酸：國藥集團化學試劑有限公司；電子天平XS225A-SCS：Precisa；LG-500A十兩裝高速中藥粉碎機：浙江瑞安市百信藥機器械廠；CT-6023pH計：深圳市柯迪達電子有限公司；HH-S型水浴鍋：鄭州長城科工貿有限公司；KQ 3200 DE型數控超聲波清洗器：昆山市儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；RT-9100型半自動生化分析儀：深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.2方法

1.2.1單因素及正交試驗

首先，參照文獻提取核桃蛋白[9]，接著，以水解度為指標，選用堿性蛋白酶，依次考察酶添加量、底物濃度、酶解pH、酶解溫度、酶解時間對堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的影響，選擇交互作用較大的三因素進行三水平的正交試驗，從而確定堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳酶解條件。

1.2.2蛋白質含量測定

供試品溶液的制備：分別稱取一定量的核桃蛋白，在木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酶1和酶2的最佳酶解條件下酶解得到相應酶解產物。各酶解產物冷凍干燥后，分別稱取5 mg，用去離子水配制成1 mg/mL后4 000 r/min離心10 min取上清液待測。

標準曲線的制作及樣品蛋白質含量測定：按BCA蛋白含量測定試劑盒方法測定。

1.2.3 DPPH自由基清除率測定[10]

將上述供試品溶液用去離子水稀釋成一系列濃度，取0.5 mL樣品加入0.5 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，搖勻置于37℃水浴30 min后測定517 nm處吸光度，每份樣品平行操作2次。DPPH清除率/%=[（A空白-A樣品）/A空白]×100，式中A空白為0.5 mL DPPH乙醇溶液與0.5mL去離子水混合后的吸光度，A樣品為0.5mL DPPH乙醇溶液與0.5 mL樣品混合后的吸光度。

1.2.4 ABTS測定[11]

2結果與分析

2.1酶添加量對酶解反應的影響

酶添加量對酶解反應的影響結果見圖1所示。

圖1酶添加量對核桃蛋白水解度的影響Fig.1 The ratio of enzyme and substrate quality on walnut protein hydrolysis

酶添加量（酶與底物質量比）在1 %～7 %（核桃蛋白均為2.5 g，酶添加量分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 g，即酶活依次為5、10、15、20、25、30、35 U）范圍內，隨堿性蛋白酶酶添加量的升高水解度呈先增大后減小趨勢，在4 %時取得最佳水解度為14.52 %。

2.2底物濃度對酶解反應的影響

底物濃度對酶解反應的影響結果見圖2所示。

圖2底物濃度對核桃蛋白水解度的影響Fig.2 The effect of substrate concentration on walnut protein hydrolysis degree

在一定范圍內，堿性蛋白酶對核桃蛋白水解度隨底物濃度的升高呈波動的趨勢，如圖，堿性蛋白酶在底物濃度不超過4 %時，隨著底物濃度增加，水解度逐漸增大，底物濃度超過4 %后，水解度呈下降趨勢，當核桃蛋白濃度為4 %時，水解度最大為22.52 %。

2.3酶解pH對酶解反應的影響

酶解pH對酶解反應的影響結果見圖3所示。

圖3酶解pH對核桃蛋白水解度的影響Fig.3 The effect of enzyme solution pH on walnut protein hydrolysis

酶解pH在7.5～10范圍內，隨反應pH的升高水解度整體呈先增大后減小趨勢，pH為9是堿性蛋白酶酶解反應較適宜pH，其水解度為12.23 %。

2.4酶解溫度對酶解反應的影響

酶解溫度對酶解反應的影響結果見圖4所示。

圖4酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響Fig.4 The effect of enzyme solution temperature on the degree of walnut protein hydrolysis

55℃為堿性蛋白酶酶解反應較適宜溫度，其水解度為11.14 %。

2.5酶解時間對酶解反應的影響

酶解時間對酶解反應的影響結果見圖5所示。

圖5酶解時間對核桃蛋白水解度的影響Fig.5 The effect of enzyme solution time on the degree of walnut protein hydrolysis

在一定條件下，堿性蛋白酶對核桃蛋白酶解隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢，酶解最佳時間為6h，其水解度為12.05 %。

2.6堿性蛋白酶正交試驗

堿性蛋白酶正交試驗因素水平表見表1，其試驗結果見表2。

表1堿性蛋白酶正交試驗因素水平表Table 1 The factors and the level of Alcalase orthogonal test

表2堿性蛋白酶正交試驗結果與分析Table 2 The results and analysis of Alcalase orthogonal test

影響堿性蛋白酶酶解核桃蛋白水解度的各因素主次順序是：B﹥C﹥A，即酶添加量影響最大，酶解時間其次，底物濃度最小。另kA1≠kA2≠kA3說明A因素的水平變動對試驗結果有影響，由kA1>kA2>kA3可斷定A1為A因素的優水平，同理B3和C2分別為B、C兩因素的優水平。后經3次試驗驗證表明：A1B3C2組水解度（平均水解度50.72 %）比A2B3C2（47.34 %）大，故堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝條件為：A1B3C2，即底物濃度為3 %，酶添加量為5 %，酶解時間為6 h。

2.7蛋白質含量測定

以蛋白質含量為橫坐標，以其吸光度值為縱坐標，得蛋白質含量測定標準曲線，并得到回歸方程y= 21.767x+0.001 8，R2=0.999 2。根據蛋白質標準曲線計算核桃蛋白不同酶解物中蛋白質含量結果見表3。

2.8 DPPH自由基清除率測定

將酶1、酶2、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解產物用去離子水稀釋成一系列濃度，按照DPPH方法測定A517，計算DPPH·清除率，結果見圖6。

表3不同酶解產物中蛋白質含量Table 3 Different enzymic protein content in the product

圖6核桃多肽對DPPH·的清除作用Fig.6 Walnut polypeptide on DPPH·scavenging effect

其中，酶解物濃度對應的DPPH·清除率為：酶1產物（569μg/mL）清除率為54.16%；酶2產物（509μg/mL）清除率為56.70 %；堿性蛋白酶產物（561 μg/mL）清除率為55.64 %；木瓜蛋白酶產物（513 μg/mL）清除率為69.88 %。

2.9 ABTS測定

移取1.2.2配制的酶1、酶2、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解產物待測液，按照ABTS方法測定A734，計算ABTS自由基清除率，結果見表4。

表4核桃多肽對ABTS自由基的清除作用Table 4 Walnut polypeptide on ABTS free radical removal effect

3結論與討論

以核桃蛋白為原料，以水解度為指標，通過單因素的考察和正交試驗的優化，確定了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳條件為：酶添加量5 %，底物濃度3 %，酶解pH為9.0，酶解溫度55℃，酶解時間6 h。酶1、酶2、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自最佳酶解條件下獲得的核桃多肽產物，其可溶性蛋白質含量差異較大，其中木瓜蛋白酶產物（67.21 %）﹥酶2產物（59.39 %）> 酶1產物（49.90 %）﹥堿性蛋白酶產物（47.13 %）；各產物對DPPH·和ABTS自由基具有一定的清除率，其中，對DPPH·清除率大小依次為：木瓜蛋白酶產物69.88 %（513 μg/mL），酶2產物56.70 %（509 μg/mL），堿性蛋白酶產物55.64 %（561 μg/mL），酶1產物54.16 %（569 μg/mL）；對ABTS自由基清除率大小依次為：酶2產物64.83 %（92.55 μg/mL），木瓜蛋白酶產物53.63 %（93.27 μg/mL），酶1產物53.49 % （103.45μg/mL），堿性蛋白酶產物49.85%（102.18μg/mL）。本研究發現，各酶解產物的抗氧化性大小與各自可溶性蛋白質含量幾乎呈正相關關系；另在體內抗氧化研究中，酶1產物呈現較強抗氧化性及其降血脂活性，其機理有待進一步研究。

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Studies on the Preparation of Walnut Polypeptide and Its Antioxidant Activity in Vitro

YAN Xiao-jie1，JIANG Zhou-tian1，2，YANG Zi-ming1，ZHENG Li-lang1，3，LI Dian-peng1，*
（1. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，Guilin 541006，Guangxi，China；2. College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541006，Guangxi，China；3. College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China）

Abstract：With walnut protein as raw materials and degree of hydrolysis as indicators，alcalase was optimized by single factor and orthogonal experiments to obtain the process parameters of prepare walnut antioxidant peptides. The optimal enzymolysis conditions were as follows：the ratio of enzyme and substrate quality was 5 %，substrate concentration was 3 %，enzymolysis temperature was 55℃，enzyme solution pH was 9.0，enzymolysis time was 6 h. Under the optimum conditions for enzymatic walnut polypeptides have obtained certain oxidation resistance.

Key words：alcalase；walnut protein；enzymatic hydrolysis；antioxidant

收稿日期：2014-09-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.010

*通信作者

作者簡介：顏小捷（1985—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事植物資源開發與利用研究。

基金項目：廣西植物研究所基本業務費項目（桂置業13001和桂置業15011）