富含右旋糖苷番茄汁發酵飲料研制

韓瑨，吳正鈞，游春蘋，高彩霞（.乳業生物技術國家重點實驗室，上海0046；.上海乳業生物工程技術研究中心，上海0046；.光明乳業股份有限公司光明乳業研究院，上海0046）

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富含右旋糖苷番茄汁發酵飲料研制

韓瑨1，吳正鈞2，游春蘋3，高彩霞3
（1.乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436；2.上海乳業生物工程技術研究中心，上海200436；3.光明乳業股份有限公司光明乳業研究院，上海200436）

摘要：腸膜明串珠菌BD1710可在番茄汁蔗糖培養基中代謝合成右旋糖苷，其發酵液可作為主要原料來勾兌制備富含右旋糖苷的發酵飲料，通過正交試驗確定了該多糖飲料的配方為：發酵液用量30 %（體積分數）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2%，優選配方制備的發酵飲料中多糖含量可達1.0%以上。

關鍵詞：腸膜明串珠菌BD1710；右旋糖苷；番茄汁蔗糖培養基

多糖（polysaccharide）是一類由多個相同或不同類型單糖縮合而成的高分子碳水化合物，其廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中，由于其具有免疫調節（牛膝多糖）[1]、降血糖（苦瓜多糖）[2]、抗腫瘤（香菇多糖）[3]、抗衰老（海帶多糖）[4]等生物活性，以及增加穩定性（紅棗多糖）[5]、促進澄清（魔芋多糖）[6]等優良的加工性能，因此近年來被越來越多地應用于多糖類保健飲料中。根據多糖來源的不同，這些產業化的多糖飲料主要采用了3類多糖：植物多糖、真菌多糖以及細菌多糖。其中，植物多糖主要來自植物的莖、葉以及種子，因其普遍存在性而應用最廣，真菌多糖大多來源于真菌的菌絲體、菌柄以子實體，而細菌多糖主要指由微生物在生長代謝過程中分泌到胞外的粘液多糖，出于食用安全性的考慮以及相關法律法規的限制，目前應用于飲料產品中的細菌性多糖僅限于包括乳酸菌在內的少數微生物，而乳酸菌胞外多糖的降血壓[7]、免疫調節[8]等益生作用已獲得廣泛的認同，因此，富含乳酸菌多糖飲料的開發有助于推動細菌多糖在功能性飲料領域進一步的應用。

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一類的高產多糖乳酸菌，研究表明，由L. mesenteroides合成的多糖大多為主鏈以葡萄糖經α-（1→3）、α-（1→4）或α-（1→6）糖苷鍵鍵合而成的葡聚糖（Glucan），如主鏈僅以α-（1→6）糖苷鍵將葡萄糖聚合而成的dextran[9]，主鏈由α-（1→6）和α-（1→3）交替鍵合而成的alternan[10]等。這些結構各異的葡聚糖在改善發酵制品的質地、生物分離（Sephadexgels）、醫藥（代血漿）等方面發揮著不同的作用[9]。然而，目前L. mesenteroides多糖通常以化學合成培養基（Chemically defined medi－um，CDM）[11]為基料發酵獲得，需經不同方法（Sevag 法[12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14]）提純后才能應用于相關產品中。發酵基料組成的復雜性，繁瑣的多糖制備工藝導致的成本問題以及有機溶劑純化時潛在的殘留風險成為L. mesenteroides多糖商業化應用的不利因素。因此，尋找一種來源廣泛、價格低廉、且可直接飲用的發酵介質是L. mesenteroides多糖飲料研發的關鍵。

前期研究發現，L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432）在番茄汁蔗糖培養基中可發酵產多糖，經結構解析確定為右旋糖苷。因此，本文首先比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養基后，其發酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量，以確定適于大規模生產的優選培養基配方，進而以正交試驗為手段，研究了發酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對飲料感官效果的影響，確定了BD1710番茄汁發酵飲料的最佳工藝配方。此外，還對優選配方制備獲得的飲料的感官指標、理化指標及微生物指標進行了測定，旨在為開發一種富含右旋糖苷的的發酵番茄汁飲料提供必要的理論依據。

1材料與方法

1.1菌種與試驗材料

菌種L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432），由光明乳業股份有限公司提供；

M17瓊脂/液體培養基：OXOID LTD.，英國；成熟番茄、蔗糖：市售；檸檬酸（食品級）：市售；NaOH、無水乙醇：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2主要儀器設備

主要儀器設備見表1。

表1主要儀器設備Table 1 Experimental apparatus and equipment

1.3方法

1.3.1工藝流程

工藝流程如下。

1.3.2發酵種子的制備

從L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432）深冷保藏管中以接種環挑取少量菌粉劃線于M17蔗糖瓊脂培養[以5.0%（g/mL）蔗糖取代M17培養基中0.5% （g/mL）的乳糖，在120℃下滅菌20 min即得]上，28℃好氧培養24 h取出，用接種環挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養基中，采用渦旋混合儀將細胞均勻分散后，28℃、180 r/min搖床培養48 h取出，再以2 %（體積分數）接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養基中，于28℃、180 r/min搖床培養48 h，培養液經15 000 g離心10 min后取沉淀，并以相同體積的無菌蒸餾水重懸，即得發酵用的種子。

1.3.3番茄汁蔗糖培養基的制備

1）番茄汁的制備：成熟番茄清洗、去皮，榨汁，果汁部分經多層紗布過濾后，經15 000 g離心10 min，取清液即得。

2）番茄汁蔗糖培養基的制備：向100 %（體積分數）的番茄汁中加入5 %、10 %、15 %、20 %（g/mL）的蔗糖，加熱溶解并冷卻后，用5.0 mol/L NaOH調節pH至7.0，在120℃下滅菌20 min即得相應蔗糖濃度的無菌番茄汁蔗糖培養基。

1.3.4 L. mesenteroides BD1710番茄汁蔗糖發酵液的制備

將1.3.2方法制備的L. mesenteroides BD1710發酵種子以2.0 %（體積分數）接種量無菌操作接入1.3.3方法制備的番茄汁蔗糖培養基中，180 r/min、28℃搖床恒溫培養48 h即得發酵液。

1.3.5調配、均質和滅菌

將白砂糖、檸檬酸以一定比例完全溶解于50℃的水中，即得勾兌液。將L. mesenteroides BD1710 48 h的發酵液與上述勾兌液以一定比例充分混合均勻后在30 MPa壓力下進行均質，并于100℃滅菌20 min。

1.3.6右旋糖苷含量的測定

將不同時間獲得的發酵液在沸水浴30 min，冷卻至室溫后加入4倍體積的無菌水稀釋，15 000 g離心10 min，取上清，加入3倍體積經過預冷的無水乙醇，靜置過夜，15 000 g離心10 min，收集沉淀物，沉淀采用少量無水乙醇洗滌后，采用蒸餾水溶解后經真空冷凍干燥后即得右旋糖苷，稱重即可。

1.3.7酸度的測定

稱取10 g發酵液于三角瓶中，加入蒸餾水20 mL、1 %酚酞指示劑3滴，搖勻，以0.1 mol/L NaOH滴定至終點。所用NaOH毫升數即為發酵液酸度（°T）。

1.3.8殘余蔗糖含量的測定

吸取20 μL發酵液原液（或稀釋過的發酵液）注入1260型高效液相色譜儀（Agilent，美國）進行流速為1.0 mL/min的等度洗脫[流動相為乙腈∶水85∶15（體積分數）]，以RID示差檢測器測定待測樣品溶液的響應值（峰面積）。所測得的峰面積代入蔗糖標準溶液濃度與峰面積的線性回歸方程式中，求得發酵液中的蔗糖含量。

1.3.9多糖飲料配方正交試驗設計

以發酵液用量（A）、蔗糖添加量（B）、檸檬酸添加量（C）為因素，以飲料的感官風味為指標，進行L9（34）正交試驗設計。因素水平表如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.10感官評定標準

由20人組成的感官評定小組按表3所示標準對多糖飲料進行感官評定。

表3多糖飲料感官評定標準Table 3 Evaluation standards of polysaccharide drink

2結果與討論

2.1 L. mesenteroides BD1710優選番茄汁蔗糖發酵液配方的選擇

將L. mesenteroides BD1710接種于不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養基中，180 r/min、28℃搖床恒溫培養48 h，發酵終點處各發酵液中右旋糖苷含量、殘余蔗糖含量與酸度如圖1所示。

圖1蔗糖濃度對右旋糖苷含量、發酵液殘余蔗糖含量以及酸度的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on acidity，content of dextran and residual-sucrose of culture

從右旋糖苷含量來看，發酵終點處（48 h），蔗糖濃度為5 %的發酵液中右旋糖苷含量最低，僅為19 g/L，而右旋糖苷含量最高（32.15 g/L）的發酵液中蔗糖濃度為15 %，蔗糖濃度為10 %和20 %的發酵液中右旋糖苷含量分別為28.8 g/L和29.44 g/L。蔗糖濃度與右旋糖苷產量正相關的現象表明蔗糖是L. mesenteroides BD1710右旋糖苷合成的關鍵性原料，這與目前關于L. mesenteroides合成多糖的報道是一致的，這些研究發現，結合在L. mesenteroides菌體細胞壁上的右旋糖苷蔗糖酶（Dextransucrase）可將蔗糖水解，并依靠葡萄糖殘基在主鏈上的聚合延長作用來合成右旋糖苷[15]。

同時，隨著培養基中蔗糖濃度的不斷提高（5 %→15 %），發酵液酸度及其殘余蔗糖含量均有相應的增加，為63°T→95°T，6 g/L→41.1 g/L。而當蔗糖濃度為20 %時，酸度不再大幅度增加（96°T），而殘余蔗糖含量顯著增加70.8 g/L，這說明L. mesenteroides BD1710 在15 %的蔗糖培養基中生長產酸能力達到了極限，而更高的蔗糖濃度雖然對酸度沒有過多的影響，但是由于滲透壓過高的原因影響細胞合成多糖的性能，使其多糖產量反而低于15 %的培養基，同時導致發酵液中大量蔗糖的殘余。

綜上所述，在蔗糖濃度為15 %（g/mL）的培養基中L. mesenteroides BD1710的產糖、產酸效果最佳，因此是制備發酵飲料的優選培養基。

2.2發酵飲料配方正交試驗結果

以發酵液用量（A）、蔗糖添加量（B）、檸檬酸添加量（C）為因素進行L9（34）正交試驗，以確定最佳的原輔料配比方案，結果見表4。

由表4的R值可知，各因素對L. mesenteroides BD1710多糖飲料影響的主次順序為：A＞C＞B，即多糖發酵液的用量對飲料品質的影響最大，影響較大的是檸檬酸的添加量，而蔗糖添加量影響最小。從k值可知，最佳因素水平組合為A2B2C3，即最佳配方為發酵液用量30 %（體積分數）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。正交試驗最高評分93分一組試驗配方與最佳配方一致。可驗證A2B2C3為最佳配方組合。

表4 L9（34）正交試驗結果Table 4 Results of L9（34）orthogonal test

發酵液的用量是飲料品質高低的關鍵因素，由于明串珠菌多糖在溶液體系中本身具有穩定劑的作用[16]，因此，當發酵液用量過低時，會直接影響成品在貨架期的穩定性，其次，成品的色澤略淺，特殊的番茄汁風味與口感不明顯。而發酵液用量過高時，飲料顏色略顯渾濁，流動性差。

蔗糖添加量的高低會影響飲料的甜度，其添加量過低時，則無法掩蓋發酵液中菌株代謝所產生的苦澀味物質，給人以不愉快的感覺，而過高時，會因過甜而掩蓋了番茄的特有風味。

檸檬酸添加量同樣會對飲料的口感產生影響，適量的添加檸檬酸，會令制成的飲料口感清新、爽口，但若檸檬酸的添加量過高，制成的飲料口感因過酸而破壞了特有的番茄風味。

2.3 L. mesenteroides BD1710發酵飲料的質量標準

2.3.1感官指標

色澤：透明、淺澄黃色；酸甜比：適宜；風味：具有獨特的番茄風味；口感：柔和、清爽；組織狀態：均勻無雜質，穩定且久置無分層和沉淀現象。

2.3.2理化指標

右旋糖苷含量：1.0%蔗糖含量：6.5%；檸檬酸濃度：0.2 %。

2.3.3微生物指標

菌落總數≤100 CFU/mL；大腸菌群≤5MPN/100mL；霉菌≤30 MPN/100 mL，致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等）不得檢出。

3　討論

隨著經濟的飛速發展和人們生活水平的不斷提高，消費者在要求飲料美味可口、營養豐富的同時，更希望它們具有一定的益生功能來促進人體健康和提高生活質量，其中功能性多糖飲料因其免疫調節作用的多樣化（抗炎護肝[17]、促體液免疫與細胞免疫[18]、改善2型糖尿病[19]等）而受到消費者越來越多的追捧。

植物與真菌來源的多糖應用相對單一，只能通過熱水浸提法、水提醇沉法[20]、稀酸稀堿提取法[21]、酶法[4]等提取獲得后，再勾兌制成多糖飲料，而細菌多糖的應用顯得更靈活多變，既可通過離心、醇沉等簡易分離手段從產糖發酵液中方便獲得多糖后再深加工成相應飲料，亦可直接保留于發酵培養基中發揮其特定的益生功效與加工性能；其次，鑒于微生物合成代謝的高效性以及所需培養基的廣泛性，獲得細菌多糖的時間和物料成本均遠低于其他來源的多糖。盡管細菌性多糖優點眾多，但目前應用于飲料的細菌性多糖種類較少（大多為乳酸菌），加之較低的胞外多糖產率，如嗜熱鏈球菌（230 mg/L~270 mg/L），保加利亞乳桿菌（58 mg/L~540 mg/L）[22]，這些限制性因素成為此類多糖飲料大規模生產的最大瓶頸。

盡管L. mesenteroides是最早應用于商業化生產多糖的乳酸菌之一，但其現有的多糖發酵技術大多依賴于化學合成培養基，并且應用手段也與植物與真菌多糖相似，同為先提取后添加，鮮有利用多糖發酵液直接勾兌制備飲料的報道。研究表明，番茄汁對保加利亞乳桿菌[23]、嗜酸乳桿菌[24]以及植物乳桿菌[25]等乳酸菌具有普遍的促生長作用，但鮮見有過L. mesenteroides在番茄汁中發酵產糖的相關報道。本文在前期L. mesenteroides BD1710在番茄汁蔗糖培養基發酵產右旋糖苷的研究基礎上，首先，比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養基后，其發酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量，確定了適于大規模生產的優選培養基配方，并探討了發酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對多糖飲料感官效果的影響，明確了發酵飲料的最佳工藝配方為：發酵液用量30 %（體積分數）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。在此條件下制備獲得的飲料為淺澄黃色的透明液體，酸甜比適宜，口感柔和、清爽，具有獨特的番茄風味，組織狀態穩定、久置無分層和沉淀現象。該飲料中右旋糖苷含量達1.0%、蔗糖含量為6.5%、檸檬酸濃度為0.2 %。

以L. mesenteroides發酵番茄汁蔗糖培養基所獲得的發酵液，經勾兌來制備的發酵飲料的方法，為以往先提取多糖后添加勾兌的繁復飲料制備工藝提供了新思路，同時為乳酸菌多糖發酵果蔬汁在飲料制備方面的應用開創了新途徑，因此，可作為一種以天然果蔬汁為發酵基料大規模制備乳酸菌多糖飲料的新方法。

4　結論

1）L. mesenteroides BD1710在接種量2.0 %（體積分數）、初始pH 7.0、番茄汁濃度100 %（體積分數）、蔗糖濃度15 %、發酵溫度28℃的條件下，其代謝番茄汁蔗糖培養基的48 h發酵液中右旋糖苷含量為3.215 %、酸度95°T、蔗糖濃度4.11 %，此發酵液為用于制備發酵飲料的優選勾兌基料。

2）L. mesenteroides BD1710番茄汁發酵飲料的最佳配方為：48 h發酵液用量30 %（體積分數）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。

3）最佳配方制備的L. mesenteroides BD1710番茄汁發酵飲料為淺澄黃色的透明液體，酸甜比適宜，口感柔和、清爽，具有獨特的番茄風味，組織狀態穩定、久置無分層和沉淀現象。其中右旋糖苷含量達1.0 %、蔗糖含量為6.5 %、檸檬酸濃度為0.2 %，并且微生物指標符合國家標準。

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Preparation of Fermented Tomato Juice Beverage Rich in Dextran

HAN Jin1，WU Zheng-jun2，YOU Chun-ping3，GAO Cai-xia3
（1. State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；2. Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；3. Dairy Research Institute，Bright Dairy & Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Abstract：Leuconostoc mesenteroides BD1710 is capable of synthesis tising dextran by fermenting tomato juice-sucrose medium，and the culture could be used as primary raw material to produce such beverage rich in dextran. According to the orthogonal test results，the optimal processing parameters were as follow：fermentation 30 %（volume fraction）、sucrose 6 % and citric acid 0.2 %. Dextran content in the best formula beverage was above 1.0 %.

Key words：Leuconostoc mesenteroides BD1710；dextran；tomato juice-sucrose medium

收稿日期：2014-06-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.016

作者簡介：韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學。

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃課題“發酵乳制品乳酸菌菌種與發酵劑的研究與開發”（2013BAD18B01）；“十二五”國家863項目“優良益生菌高效篩選與應用關鍵技術”（2011AA100901）