高效液相色譜法測定多種真菌中麥角硫因含量

趙艷敏，雷智東，劉成航，劉岱琳，*（.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥教研室，天津市職業與環境危害防治重點實驗室，天津300309；.天津科曼思特醫藥科技發展有限公司，天津300457）

?

高效液相色譜法測定多種真菌中麥角硫因含量

趙艷敏1，雷智東1，劉成航2，劉岱琳1，*
（1.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥教研室，天津市職業與環境危害防治重點實驗室，天津300309；2.天津科曼思特醫藥科技發展有限公司，天津300457）

摘要：利用HPLC法對9種醫用真菌中麥角硫因的含量進行測定。采用Kromasil 100-5NH2色譜柱，以乙腈：5 mmol/L醋酸銨（80∶20，體積比）為流動相，在254nm波長下測定麥角硫因的含量。所用方法簡便、準確，測得9種真菌中麥角硫因含量范圍為0.000 0 %~0.064 1 %。9種真菌中麥角硫因的含量差異較大，其中以靈芝中含量最高，本研究為該稀有氨基酸的開發提供了新的方向。

關鍵詞：醫用真菌；麥角硫因；高效液相色譜法；含量測定

麥角硫因（L-ergothioneine，EGT）是1909年在真菌Claviceps purpurea中首次發現的一種天然稀有的手性氨基酸類化強抗氧化劑[1]，具有抗氧化[2]、清除自由基[3]、螯合金屬離子[4-5]、防止紫外線輻射損傷[6]、調節細胞內的氧化還原反應、參與細胞內能量調節以及細胞生理保護劑[7-8]等多種功能，是機體內的重要活性物質。麥角硫因以其獨特的生物學、藥理特性以及安全性、穩定性等優點，在化妝品、功能食品、制藥和生物醫學等領域展現出良好的應用前景[9]，受到國內外學者的廣泛關注。

麥角硫因在絕大多數生物體中的含量極少，而在某些真菌中含量較多[10]。我國真菌資源豐富，但目前測定麥角硫因含量的真菌種類極少，本文采用高效液相色譜法對未見報道的9種真菌中麥角硫因含量進行測定，以期為麥角硫因的科學調查和真菌的進一步合理利用提供科學參考。

1材料與方法

1.1菌種

木蹄層孔菌Fomes fomentarius、樹舌Gan-oderma applanatum（Pers. Ex Wallr）Pat.、松針層孔菌phellinuspini、云芝Coriolus versicolor、靈芝Ganoderma lucidum、樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát、硫磺菌Laetiporus sulphureus（Fr.）Murrill、粗毛褐孔菌Xanthochrous hispidus（Bull.ex-fr.）Pat.、薄皮纖孔菌Inonotus cuticularis（Bull. ex Fr.）Karst.Polyporuscuticularis （Bull.）Fr：以上真菌購自吉林、黑龍江、天津等地。

1.2試劑與儀器

麥角硫因標準品（含量98 %）：購自天津市科曼思特醫藥科技發展有限公司；娃哈哈純凈水：乙腈（色譜級）：乙酸銨（試劑級）。

LC-20AT型高效液相色譜儀（自配SPD-M20A型紫外檢測器、CTO-20柱溫箱）：日本Shimadzu公司；MT5電子天平：瑞士梅特勒－托利多公司；HH－2數字顯示恒溫水浴鍋：常州市國華儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG－9000A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海益恒實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1對照品儲備液的制備

精密稱取麥角硫因對照品適量，置于10mL棕色容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，得標準液濃度為0.112 mg/mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃保存備用。

1.3.2供試品溶液的制備

稱取不同品種真菌各2.5 g于100 mL容量瓶中，加入80 mL去離子水，于100℃水浴鍋中加熱回流提取1 h，冷卻至室溫，用去離子水定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃保存備用。

1.3.3色譜條件[11]

色譜柱：Kromasil 100-5NH2柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相采用乙腈-5mmol /L醋酸銨（80∶20）恒流洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL。對照品及硫磺菌樣品的色譜圖見圖1。

1.3.4標準曲線的繪制

精密吸取標準溶液0.5、2.5、5.0、7.5mL置于10 mL容量瓶中甲醇定容至刻度，搖勻，取新配置的4種標準溶液及標準品儲備溶液各20 μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以標準品質量濃度X/（mg/mL）為橫坐標、標準品峰面積Y/mV為縱坐標，繪制標準溶液曲線。

2結果與分析

2.1標準曲線的建立

麥角硫因標準品的標準曲線如圖2所示。

圖2麥角硫因標準品的標準曲線Fig.2 Standard curve of EGT

由圖2可知，麥角硫因在0.005 6 mg/mL～0.112 0 mg/mL范圍內與峰面積呈現良好的線性關系，在此范圍內線性回歸方程為：Y = 4.69×107X+414 056，R2= 0.999 8。

2.2方法學考察

2.2.1精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL重復進樣5次，測定色譜峰面積，計算RSD值。結果顯示RSD= 0.78 %，表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.2.2重現性試驗

精密稱取硫磺菌樣品5份，每份2.5 g，按1.2.2項下方法制備待測溶液，按1.2.3項下方法測定麥角硫因的峰面積，計算RSD=1.15，表明該方法重現性良好。

2.2.3穩定性試驗

分別于0、4、8、12、24 h精密吸取處理后的硫磺菌樣品20μL進樣，測定色譜峰面積，計算RSD為1.21%。結果表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.2.4加樣回收試驗

取已知麥角硫因含量的硫磺菌樣品2.5 g，分別加入相當于樣品中麥角硫因含量的80 %、100 %、120 %的對照品溶液，按1.2.2項下方法制備待測溶液，按1.2.3項下方法測定麥角硫因的峰面積，結果見表1。結果顯示麥角硫因加樣回收試驗良好。

2.3樣品水分含量測定[12]

取剪切成約0.5 cm×0.5 cm的真菌樣品各2 g，平鋪于干燥恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，在100℃～105℃干燥5 h。移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻稱重，至連續2次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的重量，計算樣品中的水分含量（%），平行3次，求平均值，結果見表2。

表1麥角硫因加樣回收率結果（n=3）Table 1 The addition recovery of ergothioneine（n=3）

表2 9種真菌中水分含量測定結果（n=3）Table 2 The moisture contents of nine different kinds of fungi （n = 3）

2.4樣品的測定

各樣品按1.2.2項下方法制備供試品溶液，按1.2.3項下方法測定各供試品峰面積，代入標準曲線，計算供試品中麥角硫因的濃度C（mg/mL），利用計算公式計算各樣品的含量，每個樣品平行試驗3次，結果見表3。

表3 9種真菌中麥角硫因的含量（n=3）Table 3 The contents of ergothioneine of nine different kinds of fungi（n=3）

式中：C為供試品中麥角硫因的濃度，mg /mL；V = 100 mL；M為各樣品的質量，mg；W為各樣品的水分含量，%。

3　結論

本試驗首次采用高效液相色譜法測定了9種常見的醫用真菌中麥角硫因的含量，結果顯示：除粗毛褐孔菌外，其他8種真菌均不同程度的含有麥角硫因，但不同種類的真菌中麥角硫因的含量的差異較大。麥角硫因含量由高到低依次為：靈芝＞硫磺菌＞薄皮纖孔菌＞樺褐＞云芝＞松針層孔菌＞木蹄=樹舌＞粗毛褐孔菌。

麥角硫因可以由許多微生物如真菌和放線菌自身合成，存在于真菌、谷物、等多種植物體內，尤以真菌中存在最為普遍[14]。我國真菌資源豐富，但目前國內對麥角硫因的研究多集中于食用真菌，本文的研究為麥角硫因的開發利用提供了新的方向。

參考文獻：

[1] Tanret C. Sur une base nouvelle retiree du seigle ergote, L-Ergothioneine Compt[J]. Rend Acad Sci, 1909, 149: 222-224

[2] FRANZONI F, COLOGNATO R, GALETTA F, et al. An in vitro study on the free radical scavenging capacity of ergothioneine: comparisonwithreducedglutathione,uricacid and trolox[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2006, 60(8) :453-457

[3]林陳水,付水星,黎小軍,等.一種稀有的天然氨基酸-麥角硫因[J].氨基酸和生物資源,2006,28(1):63-67

[4] SPEISKY H, GOMEZ M, CARRASCO-POZO C, et al. Cu (I) -Glutathione complex: A potential source of superoxide radicals generation[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008,16(13):6568-6574

[5]朱本占,毛莉,范瑞梅,等.天然抗氧化劑麥角硫因保護銅所致DNA和蛋白質氧化損傷的作用機理[J].科技通報,2011,56(27): 2283-2288

[6] MARKOVA N G, KARAMAN-JURUKOVSKA N, DONG K K, et al. Skin cells and tissue are capable of using L-ergothioneine as an integral component of their antioxidant defense system[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2009, 46(8): 1168-1176

[7]張萌萌,張倩,張國琛.金針菇提取液中麥角硫因氨基酸的功能及其在食品工業中的應用前景[J].安徽農業科學,2014,42(11): 3385-3387,3390

[8]張翠,趙艷敏,白淑芳,等.HPLC法測定不同品種蘑菇中麥角硫因的含量[J].食品工業科技,2013,23(34):307-310

[9]李軼群,周念波.麥角硫因的生物學功能及其應用[J].食品工程, 2010(3):26-28

[10] EY J, SCHOMIG E, TAUBERT D. Dietary sources and antioxidant effects of ergothioneine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(16) : 6466-6474

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄52

Determination of Ergothioneine in Multiple Species of Fungi by HPLC

ZHAO Yan-min1，LEI Zhi-dong1，LIU Cheng-hang2，LIU Dai-lin1，*
（1. Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard，Department of Pharmacognosy，Logistics College of Chinese People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China；2. Tianjin Chroma-standard Medical Science & Technology Development Co. Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：Ergothioneine in nine species of fungi were determined by HPLC. The samples were analyzed by kromasil 100-5 NH2column with elution（acetomitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution（80∶20，volume ratio）as mobile phase. The detection wavelength was 254 nm. The method was simple and reliable. The contents of ergothioneine in fungi were in the range of 0.000 0 %-0.064 1 %. The hightest content occurred in lucid ganoderma. This study supplied a new train of thought to the development and utilization of ergothioneine.

Key words：fungi；ergothioneine；HPLC；contents determination

收稿日期：2014-09-12

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.029

*通信作者：劉岱琳（1973—），女（漢），教授，研究方向：天然產物活性成分研究。

作者簡介：趙艷敏（1987—），女（漢），助教，碩士，研究方向：天然產物活性成分研究。

基金項目：天津市科技支撐項目（12ZCZDNC01500）