一種適用于真菌的高通量分子鑒定方法的建立

曹樹威，蔡小艷，賴大偉，易顯鳳，黃日波，賴志強(qiáng)，*（.廣西畜牧研究所，廣西南寧530000；.廣西科學(xué)院，廣西南寧530000）

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一種適用于真菌的高通量分子鑒定方法的建立

曹樹威1，蔡小艷1，賴大偉1，易顯鳳1，黃日波2，賴志強(qiáng)1，*
（1.廣西畜牧研究所，廣西南寧530000；2.廣西科學(xué)院，廣西南寧530000）

摘要：真菌在生物領(lǐng)域扮演著重要的角色，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，從分子水平對(duì)真菌的鑒定及對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證成為必需的試驗(yàn)環(huán)節(jié)。但目前尚無一種比較理想的高通量分子鑒定的方法。設(shè)計(jì)一種新的高通量裝置，并且建立適用于這種高通量裝置的，由PCR介導(dǎo)的分子鑒定方法，主要通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用菌株里氏木霉基因組上相關(guān)纖維素酶編碼基因、調(diào)控基因，釀酒酵母基因組上磷酸甘油酸激酶1基因的啟動(dòng)子區(qū)，釀酒酵母胞內(nèi)表達(dá)載體上木聚糖酶基因的克隆驗(yàn)證及對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉及上述兩株菌株的ITS基因克隆驗(yàn)證，RAPD分析，確定這種方法的高效性及應(yīng)用廣泛性。這種方法的建立很大程度上解決了高通量分子鑒定的瓶頸問題。

關(guān)鍵詞：真菌；高通量；分子鑒定；RAPD

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于微生物資源的發(fā)掘利用不斷深入。真菌相對(duì)于原核生物具有更發(fā)達(dá)的酶系和分泌機(jī)制，真菌資源的開發(fā)具有美好前景。因此對(duì)于真菌的基因操作具有重要的意義。但真菌具有較厚的細(xì)胞壁，較多的蛋白及多糖。傳統(tǒng)的基因組提取法能得到質(zhì)量較好的基因組，滿足PCR技術(shù)的要求。但是對(duì)于大量菌株的鑒定而言，傳統(tǒng)的方法則需要大量的勞動(dòng)量，消耗大量的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)器材，很難滿足高通量鑒定的要求[1-2]。雖然各研究者對(duì)傳統(tǒng)的方法改良[3-6]得到了很多新方法，但這些方法的大框架仍未脫離傳統(tǒng)方法。脫離傳統(tǒng)的方法，則鑒定受雜蛋白及多糖的影響而很難進(jìn)行。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種簡易的高通量裝置，建立了一種高通量法，3 min~5 min即可滿足一個(gè)真菌菌株P(guān)CR驗(yàn)證的需求，相對(duì)于已報(bào)道的其它高通量法，無需平皿或搖瓶等占用空間的實(shí)驗(yàn)器材養(yǎng)菌，PCR穩(wěn)定性很好，節(jié)省時(shí)間，操作簡單，PCR產(chǎn)物濃度大，滿足測(cè)序的要求。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基，YPS液體培養(yǎng)基（1L）：Yeast extraction 10 g，Peptone 10 g，Sucrose 10 g。

1.1.3其他相關(guān)材料

rTaq（TaKaRa），DL2000 DNA Marker，λHindIII DNA digest Marker，34 mg/mL氯霉素保藏液，chelex-100，去離子水，石英砂，脫脂棉，1.5 mL EP管，牙簽，渦旋振蕩器，指形瓶。

1.2方法

1.2.1簡易高通量裝置的設(shè)計(jì)及獲取分子鑒定材料的應(yīng)用

用圓面直徑1 mm的金屬棒，一端在酒精燈上燒熱，在1.5 mL EP管蓋中心戳一個(gè)孔，在蓋子內(nèi)側(cè)凹陷處填入脫脂棉40 mg，蓋上蓋子高溫高壓滅菌后備用。超凈臺(tái)內(nèi)，用1 mL移液槍吸取800 μL滅菌后冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基至上述裝置內(nèi)，平放，形成斜面，冷卻備用。同時(shí)用未處理1.5 mL無菌lEP管做同樣的斜面，作為對(duì)照。用滅菌牙簽分別點(diǎn)接各種絲狀真菌真菌至對(duì)照及高通量斜面上，30℃恒溫箱培養(yǎng)。5 d后，吸取500 μL含34 μg/mL氯霉素的YPS培養(yǎng)基分別至對(duì)照及高通量裝置內(nèi)，用槍頭吹洗，將吹洗液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)無菌指形瓶，再加入1 mLYPS培養(yǎng)基至指形瓶內(nèi)，30℃，130 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h。對(duì)于酵母等非絲狀真菌，無需通過上述高通量裝置，直接接種至指形瓶內(nèi)1.5 mL YPS培養(yǎng)基中，30℃，130 r/min恒溫?fù)u床23 h。

1.2.2分子鑒定模板的快速獲取

從指形瓶吸取適量培養(yǎng)物至1.5 mL EP管中，12 000 r/min，30 s，棄上清，加入1 mL無菌去離子水，吹洗5s，12000r/min，30s，棄上清，菌體離心后濕重30mg左右，再加入300 μL無菌去離子水，加入25 mg無菌石英砂，蓋好后2500r/min渦旋振蕩器上40s，12000r/min，15 s離心，吸上清100 μL至裝有5 mg~10 mg無菌chelex 100的1.5 mL EP管內(nèi)，適當(dāng)搖勻一下即轉(zhuǎn)入沸水浴，1 min后取出冷卻后即可用于PCR模板。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室研究菌株里氏木霉，釀酒酵母相關(guān)基因的PCR驗(yàn)證

以1.2.2中里氏木霉，釀酒酵母兩株菌的處理物分別做PCR模板。50 μL PCR反應(yīng)體系：5 U/μL rTaq 0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPmix 4 μL，DNA 1 μL，20 μmol/L正反引物各1 μL，ddH2O37.75 μL。以里氏木霉處理物做PCR模板擴(kuò)增位于基因組上的纖維素酶內(nèi)切酶編碼基egl1（Primer-es1：5’-ACAC CTCGGTGGTCCTTGACTG - 3’，Primer - ea1：5’-AGTCGTCGAGCTCCTCCGTGTAGT-3’），纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控基因ace2（Primer -ace2F：5’-GGATCGTGGGATGT GATG -3’，Primer -ace2R：5’-CGGCACAAGTTCTGTTCAG-3’），碳代謝阻遏因子編碼基因cre1（Primer-cs1：5’-GGTGCAAGGCTGCTAGGCAAT -3’，Primer -ca2：5’-CCGTTGGGGAAAGTG GTGATGTCT-3’），纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控基因ace1 （Primer -as1：5’-TG GTGTTTGCGGTTCGCTCTTC -3’，Primer -aa1：5’-CGATTCCCAGTATCGGAGAACATC-3’）；以釀酒酵母處理物做PCR模板擴(kuò)增位于基因組上的磷酸甘油酸激酶1基因啟動(dòng)子PKG1 （Primer-：5’-AGTCGTCGAGCTCCTCCGTGTAGT-3’，Primer-：5’-AGTCGTCGAGCTCCTCCGTGTAGT-3’）及位于表達(dá)載體上的木聚糖酶編碼基因xynB（Primer-XynB -H2：5’- CGGCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGCTGAACAG TGATGGAGGAAG -3’，PrimerxynB1：5’- CCG GAATTCAAAAAAATGCTCACCAAGAAC-3’）。取3μL PCR反應(yīng)液電泳檢測(cè)。

1.2.4實(shí)驗(yàn)室研究菌株里氏木霉、釀酒酵母及保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等真菌ITS序列的PCR驗(yàn)證

ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作引物，以各菌1.2.2處理物做模板，擴(kuò)增ITS基因，50μLPCR反應(yīng)體系：5 U/μL rTaq 0.25 μL，10×PCR Buffer5 μL，2.5 mmol/L dNTPmix 4 μL，DNA1 μL，20 μmol/L正反引物各1 μL，ddH2O37.75 μL。取3 μL PCR反應(yīng)液電泳檢測(cè)。

1.2.5實(shí)驗(yàn)室研究菌株里氏木霉、釀酒酵母及保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等真菌的RAPD分析

以各菌1.2.2處理物做模板，以Primer11（5’-GTCTTGCGGA-3’）作引物，50μLPCR反應(yīng)體系：5 U/μL rTaq 0.25 μL，10×PCR Buffer5 μL，2.5 mmol/LdNTPmix 4 μL，DNA1μL，20μmol/LPrimer114μL，ddH2O35.75μL。取3 μL PCR反應(yīng)液電泳檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1簡易高通量裝置獲取分子鑒定材料效果

在本試驗(yàn)中，5 d后，高通量裝置斜面上長滿厚厚的菌絲，且高度孢子化，而對(duì)照則看到一層半透明狀的薄膜貼在斜面表面，未見氣生菌絲生長。分別用YPS培養(yǎng)液吹洗并轉(zhuǎn)移至指形瓶內(nèi)，高通量裝置內(nèi)的吹洗液渾濁，而對(duì)照裝置內(nèi)的吹洗液則透明。指形瓶在30℃，130 r/min搖床上，18 h后，指形瓶液面附近內(nèi)壁上明顯看到菌絲團(tuán)附著，液體則高度渾濁，且略呈絮狀，滿足了分子鑒定材料的需求；對(duì)照吹洗液則仍透明，未見菌絲生長，說明設(shè)計(jì)的裝置明顯具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于釀酒酵母，指形瓶培養(yǎng)，30℃，130 r/min搖床上，23 h后培養(yǎng)液從原來接種時(shí)的略渾濁變成高度渾濁，瓶內(nèi)可以嗅到淡淡的酒精味道。

2.2實(shí)驗(yàn)室常用菌株里氏木霉及釀酒酵母相關(guān)基因的PCR驗(yàn)證

為了檢測(cè)快提法獲得產(chǎn)物進(jìn)行分子鑒定的可行性，分別對(duì)里氏木霉纖維素內(nèi)切酶編碼基因egl，纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控基因ace2，碳代謝阻遏因子編碼基因cre1，纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控基因ace1及釀酒酵母磷酸甘油酸激酶1基因啟動(dòng)子區(qū)PKG1，釀酒酵母胞內(nèi)表達(dá)載體上木聚糖酶基因xynB進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1。

M1為DL2000 DNA Marker；M2為λHindIII DNA digest Marker；1為里氏木霉egl1基因；2為里氏木霉ace2基因；3為里氏木霉cre1基因；4為里氏木霉ace1基因；5為釀酒酵母PKG1基因；6為釀酒酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)載體上xynB基因。圖1里氏木霉及釀酒酵母相關(guān)基因的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR assay of related genes in Trichoderma reesei and S. cerevisiae

條帶清晰且亮，說明快提法獲得的產(chǎn)物可以很好的應(yīng)用于分子鑒定；通過酵母的相關(guān)分子驗(yàn)證，說明快提法不僅可以應(yīng)用于基因組基因的鑒定，也可應(yīng)用于獨(dú)立于基因組之外表達(dá)載體上基因的鑒定，即可很好的應(yīng)用于真菌轉(zhuǎn)化子的鑒定。

2.3實(shí)驗(yàn)室常用菌株里氏木霉、釀酒酵母及保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等保守基因序列ITS的PCR驗(yàn)證

針對(duì)所述實(shí)驗(yàn)室各種菌獲得的快提產(chǎn)物進(jìn)行ITS序列的PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2。

M為DL2000 DNA Marker；1、2、3、4、5、6、7分別為里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等真菌的ITS序列圖譜。圖2里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等ITS的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR assay of ITS in Trichoderma reesei，S. cerevisiae，Penicillium oxalicum，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger，Aspergillus carbonarius，Aspergillus japonicas.

條帶清晰且亮，可以很好地滿足測(cè)序要求，說明快提法在真菌分子鑒定方面的應(yīng)用具有廣泛性。

2.4實(shí)驗(yàn)室常用菌株里氏木霉、釀酒酵母及保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等RAPD驗(yàn)證

針對(duì)所述實(shí)驗(yàn)室各種菌獲得的快提產(chǎn)物進(jìn)行RAPD驗(yàn)證，結(jié)果如圖3。

M1為DL2000 DNA Marker；M2為λHindIII DNA digest Marker；1、2、3、4、5、6、7分別為里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等真菌RAPD圖譜。圖3里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等RAPD分析Fig.3 RAPD analysis of PCR assay of ITS in Trichoderma reesei，S. cerevisiae，Penicillium oxalicum，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger，Aspergillus carbonarius，Aspergillus japonicas.

條帶較清晰，可以看到快提法可以應(yīng)用于不同真菌基因組多態(tài)性分析。

3　討論

真菌的分子鑒定，尤其是絲狀真菌的鑒定，由于其相對(duì)原核生物更復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其具有一定的難度。傳統(tǒng)的基因組提取方法，可以獲得質(zhì)量較高的分子鑒定模板，很好地應(yīng)用于各種PCR試驗(yàn)，效率往往較低，只適用于少量樣品的分子鑒定；很多改良的基因組提取法雖然可以適當(dāng)提高效率，但未擺脫對(duì)人體傷害較大的化學(xué)藥品，操作仍較繁瑣[7-8]，時(shí)間雖然適當(dāng)縮短，仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足短時(shí)間內(nèi)真菌高通量鑒定的需求。對(duì)于非絲狀真菌酵母，雖然曾有菌落PCR方法報(bào)道，但作者曾進(jìn)行驗(yàn)證，因其重復(fù)性差且而擱置此種方案，初步推測(cè)由于多糖及雜蛋白的污染導(dǎo)致PCR效果不理想。Tendulkar曾報(bào)道利用適量TE buffer浸潤菌絲，然后用微波處理適當(dāng)時(shí)間，離心上清即可用于PCR實(shí)驗(yàn)[9]。作者曾多次重復(fù)這種方法，但尚未成功。作者認(rèn)為，對(duì)于這種方法，雖然微波裂胞后，EDTA可以螯合激活Dnase活性的金屬離子，但大量的雜蛋白及多糖尚在，仍能嚴(yán)重干擾PCR試驗(yàn)，用含有EDTA的上清做PCR模板，激活Taq酶活性的Mg2+會(huì)被部分螯合，致使Taq酶不能充分發(fā)揮作用，導(dǎo)致PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差[10]。本實(shí)驗(yàn)解決了高通量鑒定真菌的關(guān)鍵問題。

1）首先，高通量裝置的設(shè)計(jì)在保證能滿足分子鑒定菌體需求量的前提下，大大簡化了菌料收集工作，可以一次性輕松點(diǎn)接數(shù)百至上千個(gè)待鑒定菌，只占用很小的空間進(jìn)行培養(yǎng)。絲狀真菌的繁茂生長對(duì)氧的需求量較大，裝置本身的設(shè)計(jì)既滿足了氧的需求又避免了雜菌的污染。對(duì)照因阻隔氧氣來源，致使絲狀真菌只能在厭氧的環(huán)境下生長，生長速度慢，肉眼觀察只有一層半透明狀薄膜貼在培養(yǎng)基上，且一直停留在此種狀態(tài)，極少量的菌絲孢子化，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用的要求。

2）本試驗(yàn)所建立的PCR模板快提法，在3 min~ 5 min即可獲得一株菌的分子鑒定模板，明顯的優(yōu)勢(shì)在于獲得的模板用于PCR實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好，PCR產(chǎn)物濃度高，滿足測(cè)序的要求。這種方法先利用石英砂裂胞，釋放微量的DNA。Chelex 100是一種螯合樹脂，能夠螯合降解DNA酶的激活劑，吸附多糖及其他多種有機(jī)物，同時(shí)沸水浴可以使蛋白不可逆變性。

3）本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌株里氏木霉、釀酒酵母、草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉等5個(gè)屬的真菌進(jìn)行分子鑒定，效果理想；同時(shí)也對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染培養(yǎng)基的一些未知屬的絲狀真菌進(jìn)行驗(yàn)證，均可獲得較好效果，因此本試驗(yàn)方法具有應(yīng)用廣泛性。

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Development of A Protocol Suitable for Molecular Identification of Massive Fungus Strains

CAO Shu-wei1，CAI Xiao-yan1，LAI Da-wei1，YI Xian-feng1，HUANG Ri-bo2，LAI Zhi-qiang1，*
（1. Guangxi Institute of Animal Husbandry，Nanning 530000，Guangxi，China；2. Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530000，Guangxi，China）

Abstract：Fungus plays a significant role in biology-related domains and with the molecular biology technology advancing，the key step has necessitated the identification of fungus and transformant from molecular level. By far，however，there hasn't remained an ideal protocol for the massive strains identification.In the research，a device used for massive identification was designed，and a novel identification protocol mediated by PCR from molecular level，suitable for the device，was developed. In the article，through the cloning of genes encoding cellulase and relative regulatory factors which are located in genome of Trichoderma reesei，the cloning of promoter of phosphoglycerate kinase gene 1 and gene encoding xylanase，respectively located in genome and expression vector of S. cerevisiae and by ITS sequences cloning RAPD analasis of the two frequently-used strains mentioned above and strains Penicillium oxalicum，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger，Aspergillus carbonarius，Aspergillus japonicas. the protocol turned out to be an effective one with wide application potential，To a great degree，the establishment of the method has worked out the bottleneck of high-throughput molecular identification.

Key words：fungus；high throughput；molecular identification；RAPD

收稿日期：2014-11-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.031

*通信作者

作者簡介：曹樹威（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：微生物生物技術(shù)。

基金項(xiàng)目：廣西科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（14125008-2-13）