櫻桃多酚含量的福林法測定研究

張萍，王毅紅，張春生，王盼，譚萍（六盤水師范學院，貴州水城553004）

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櫻桃多酚含量的福林法測定研究

張萍，王毅紅，張春生，王盼，譚萍*
（六盤水師范學院，貴州水城553004）

摘要：采用正交設計試驗，探究以沒食子酸為標準品測定櫻桃多酚含量的福林法適宜條件。結果表明，櫻桃多酚含量福林法測定的最佳試驗條件為：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 %Na2CO3溶液的體積比為1∶2，反應時間為90 min，反應溫度為40℃。

關鍵詞：櫻桃；多酚；福林法；正交設計

櫻桃屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus L.）櫻亞屬（Cerasus Pers）植物，櫻桃屬的植物有120多種，世界上做為果樹栽培的主要有4種，即中國櫻桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）、歐洲甜櫻桃（Prunus avium Linn.）、歐洲酸櫻桃（Prunus cerasus Linn.）、毛櫻桃（Prunus tomentosa Thunb.）[1]。櫻桃作為一種營養與口味俱佳的果品，因成熟期早，有“早春第一果”的美譽，號稱“百果第一枝”，深受人們的喜愛。貴州櫻桃分布較廣，很多地方栽培種品質優良，果實色澤鮮艷、汁多、味甜酸[2]。隨著人們對食物營養成分的搭配日趨重視，水果、蔬菜等的抗氧化活性成為國內外研究的熱點，櫻桃成為其中備受關注的水果之一。市場對櫻桃及其加工食品的需求量日益擴大，栽培面積的不斷增加，但目前為止，對櫻桃的研究多見于甜櫻桃[3-7]，中國櫻桃的成分研究鮮見報道。

櫻桃含有豐富的糖分、鐵、VC、多酚類物質[8]，酚類化合物是植物次生代謝產物中的重要類型之一，因其具有顯著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性而引起人們的廣泛關注[9]。酚類化合物是一類具有大而復雜基團的化合物，從化學上講多酚以苯酚為基本骨架，以苯環的多羥基取代為特征，主要由無色多酚和色素兩類物質組成。從低分子量的簡單酚類到分子量大至數千道爾頓的單寧類，按結構可分為酚酸類、類黃酮類及1，2-二苯乙烯、花青素類和原花色素類等[10]，因此不同植物多酚的定量在方法上存在著一定的差異。目前對于貴州櫻桃多酚的福林法測定的研究尚未見報道。本實驗采用福林法，以沒食子酸為標準品測定櫻桃中多酚的含量，意在研究櫻桃多酚測定條件，為更好地開發利用這一農業資源提供一定的檢測參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

櫻桃：購于貴州省六盤水市六枝特區落別鄉，無機械損傷，顆粒均勻，成熟度好。

沒食子酸標準品：中國藥品生物制品鑒定所；鉬酸鈉：上海膠體化工廠；鎢酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；濃磷酸：重慶川東化工（集團）有限公司；濃鹽酸：重慶江川化工（集團）有限公司；硫酸鋰：廣東光華科技股份有限公司；無水碳酸鈉：重慶無機化學試劑廠；乙醇：天津市富裕精細化工有限公司；溴水：廈門海標科技有限公司；以上試劑均為分析純；水為雙蒸餾水。

1.1.2儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；METTLER TOLEDO AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1福林（FC）試劑的配制[11]

按徐輝艷等福林試劑的配制方法配制一定量的福林試劑，置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2樣品原液的制備

櫻桃去核打漿后準確稱取25 g，用100 mL 30 %乙醇溶液于35℃條件下恒溫水浴90 min，浸提液過濾后定容至100 mL，得樣品原液。

1.2.3標準曲線的制作[12]

準確稱取50 mg沒食子酸，用10 mL無水乙醇溶解，蒸餾水定容至50 mL，得標準液。準確移取10 mL沒食子酸標準液至100 mL容量瓶中定容，得濃度為0.1mg/mL標準溶液。分別移取此標準液一定量于50 mL容量瓶中，得到濃度為1 μg/mL~6 μg/mL的系列對照品溶液。經福林試劑顯色后于762 nm波長下測定吸光度。求得回歸方程，繪制工作曲線。標準曲線見圖1。

圖1標準曲線Fig.1 Standard curve

方程為y=0.131 1x+0.119 1，r=0.999 6。

1.2.4樣品原液測定

準確吸取2 mL樣品原液于50 mL容量瓶中，福林試劑的顯色操作同標準曲線的制作。

2結果與分析

2.1吸收波長的選擇

分別準確吸取樣品原液和沒食子酸標準液，經福林試劑顯色后，均在波長600 nm~850 nm范圍內掃描，兩者光吸收曲線一致，確定最大吸收波長為762 nm。

2.2福林試劑與10 %Na2CO3比例的選擇

準確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入不同量的福林試劑與10 %Na2CO3溶液，使兩者有不同的體積比，保溫顯色后于762 nm波長下測定吸光度。福林試劑與10 %Na2CO3溶液的體積比對吸光度的影響見圖2。

圖2試劑比例與吸光度的關系Fig.2 Relationship between Folin reagent-10 % Na2CO3ratio and absorbance

結果表明，當福林試劑與10 %Na2CO3體積之比為1∶2時吸光度達到最大值。

2.3福林試劑用量的選擇

準確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入不同量的福林試劑，保溫顯色于762 nm波長下測定吸光度。福林試劑的用量對吸光度的影響見圖3。

圖3福林試劑用量與吸光度的關系Fig.3 Relationship between Folin regent dose and absorbance

結果表明，相同條件下隨著福林試劑用量的增加，吸光度先增大后減小，在福林試劑體積為3 mL時達到最大值。

2.4反應時間的選擇

準確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入一定量的福林試劑，置于25℃的恒溫水浴鍋中保溫30 min~150 min，于762 nm波長下測定吸光度。反應時間對吸光度的影響見圖4。

圖4反應時間與吸光度的關系Fig.4 Relationship of reaction time and absorbance

結果表明，在一定范圍內，隨著時間的增加，吸光度緩慢增加，且90 min時吸光度達到最大值。當反應時間到達120 min后吸光度開始下降。

2.5反應溫度的選擇

準確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入一定量的福林試劑，置于15℃~45℃的恒溫水浴鍋中保溫60 min，于762 nm波長下測定吸光度。反應溫度對吸光度的影響見圖5。

圖5反應溫度與吸光度的關系Fig.5 Relationship of reaction temperature and absorbance

結果表明，隨著溫度的改變，吸光度變化明顯，且隨著溫度的升高基本呈上升趨勢，45℃達到最大值。因溫度過高對多酚的性質造成改變，故試驗溫度設計不宜過高。

2.6顯色條件正交試驗設計[13]

根據以上單因素試驗結果，為了進一步找出顯色反應的最佳試驗條件，將福林試劑用量（A）、福林試劑與10 %Na2CO3比例（B）、反應時間（C）、反應溫度（D）為考察因素，以吸光度為考察指標，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表1。

表1試驗因素水平表Table 1 Levels and factors

正交試驗驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

續表2正交試驗結果Continue table 2 Results of orthogonal test

表3方差分析結果Table 3 Analysis of variance

由表2、表3可知，影響吸光度大小的因素為B> A>D>C，即福林試劑與10 %Na2CO3比例>福林試劑用量>反應溫度>反應時間。其中A、B、C、D因素對試驗均有顯著影響（P < 0.01），故確定最佳提取工藝為B2A3D2C3，所以本試驗中確定：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 %Na2CO3比例為1∶2，反應時間為90 min，反應溫度為40℃為優選顯色工藝。用該優選條件，按1.2.4所述的試驗方法測得吸光度值為0.462，在所有提取方法中數值最大，說明B2A3D2C3為最佳提取工藝。

2.7精密度試驗

通過進行重復性試驗來檢驗本法的精密度。準確移取樣品原液4份，按1.2.4所述的試驗方法進行平行測定。結果見表4。

表4精密度試驗Table 4 Precision of method

2.8加樣回收率試驗

為進一步確定方法的準確度，準確移取同一批提取物，稀釋一定倍數后取1 mL，分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL沒食子酸標準品。按1.2.4所述的試驗方法進行平行測定，取平均吸光度求出總酚含量，計算加樣回收率。結果見表5。

表5回收率試驗Table 5 Recovery of method

3　討論

目前，利用如高錳酸鉀法[14]、紫外分光光度法[15]、酒石酸亞鐵比色法[16]等測定植物多酚的方法報道很多。不同的方法均存在一定的缺點。我們經過反復試驗，櫻桃多酚含量福林法測定的最佳試驗條件為：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 % Na2CO3溶液的體積比為1∶2，反應時間為90 min，反應溫度為40℃。優選出的條件操作簡單、顯色穩定，快速簡便，準確性高，精密度和重現性好，結果可靠。這為以后的進一步研發提供了很好的參考。

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Study on Determining Cherry Polyphenols Content by Folin Method

ZHANG Ping，WANG Yi-hong，ZHANG Chun-sheng，WANG Pan，TAN Ping*
（Liupanshui Normal College，Shuicheng 553004，Guizhou，China）

Abstract：By means of orthogonal experimental design，with gallic acid as standard，the suitable conditions for determining cherry polyphenols content by Folin method. The results showed that，the best condition determination method of Folin polyphenol content of cherry：Folin reagent amount used was 4 mL，Folin reagent and 10 % Na2CO3ratio（V/V）of 1∶2，reaction time 90 min，reaction temperature 40℃.

Key words：cherry；polyphenols；Folin method；orthogonal experimental design

收稿日期：2014-09-22

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.036

*通信作者：譚萍（1963—），女（漢），教授，本科，主要從事植物生理學與分子生物學的教學與研究。

作者簡介：張萍（1973—），女（漢），副教授，本科，主要從事無機及分析化學的教學及研究。

基金項目：六盤水師范學院科研基金資助項目（lpssy201201）