楊樹桑黃胞外多糖發酵條件優化及形態學研究

何培新，吳雙雙，許春平（鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002）

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楊樹桑黃胞外多糖發酵條件優化及形態學研究

何培新，吳雙雙，許春平*
（鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002）

摘要：采用單因素試驗和正交試驗優化了楊樹桑黃搖瓶產胞外多糖（EPS）的培養條件，并研究了優化培養基中菌絲體的形態變化。單因素試驗結果表明，楊樹桑黃產EPS的最適生長周期為8 d，最佳碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、玉米粉和KH2PO4，最適環境條件為溫度28℃，pH7。在此基礎上，選用碳源、氮源和無機鹽3個因素，應用正交試驗優化出楊黃產EPS的最佳培養基配方為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。在優化培養條件下，胞外多糖產量為0.352g/L。優化培養基的形態學結果表明，隨著發酵時間的延長，菌絲球逐漸增大，平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負相關，表現為先減小后增加的趨勢。

關鍵詞：楊樹桑黃；優化；胞外多糖；形態學

楊樹桑黃即瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii Ljup），又名楊黃，屬擔子菌亞門（Basidiomyeotina），層菌綱（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木（針）層孔菌屬（Phellinus）[1]，有“森林黃金”之美稱。瓦尼木層孔菌以生長在天然林中老齡的楊樹上，且子實體孔口表面呈黃色菌蓋邊緣為黃色帶狀環紋而得名[2]，人工林中很難找到。該菌具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成活性等多種藥理作用[3-5]。2005年以來，人們對瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經獲得成功[6-8]，但是關于瓦尼木層孔菌活性物質提取的研究相對較少，鮮有與其多糖相關的報道。

本文主要優化楊樹桑黃發酵培養產胞外多糖條件，進行菌株的活化培養，在單因素試驗的基礎上，以EPS產量為觀察指標，采用正交試驗優化碳源、氮源等人工培養條件，并研究了其形態學。研究結果為楊樹桑黃胞外多糖的產品開發奠定了扎實的理論和技術基礎，對其他真菌的相關研究也具有一定的借鑒價值。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

楊樹桑黃：來源于鄭州輕工業學院發酵工程研究室，于斜面培養基上4℃保存。

1.1.2主要儀器

ΜV-17001C紫外分光光度計：上海鳳凰光學科儀有限公司；SFLY-100B臺式小容量恒溫培養搖床、DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海申賢恒溫設備廠；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環水多用真空泵：西安太康生物科技有限公司；Nikon E-100顯微鏡（配有DT2000圖像分析軟件）：尼康儀器有限公司。

1.1.3試劑

葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、牛肉膏、蛋白胨、多價胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、FeSO4、CuSO4、MgSO4、CaCl2、K2HPO4、NaCl、HCl、NaOH、乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純，購自天津市風船化學試劑有限公司。

1.1.4培養基

PDA培養基：200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，108 g瓊脂，蒸餾水補至1 000 mL，pH自然。

基礎培養基：30 g葡萄糖，3 g蛋白胨，蒸餾水補至1 000 mL，pH自然。

1.2方法

1.2.1菌種活化

將保存的試管斜面菌種轉接PDA平板，26℃恒溫培養7 d。

1.2.2種子液的制備

用打孔器打取活化好的真菌菌絲塊（約1cm2）兩塊接入含50 mL種子培養液的250 mL三角瓶中，搖瓶轉速為160 r/min，于26℃振蕩搖床中培養4 d。然后加入無菌玻璃珠，置于磁力攪拌器上將菌絲球打碎后備用。

1.2.3葡萄糖標準曲線的制作[9-10]

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品1.02g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻，即為葡萄糖標準母液。精確量取1 mL母液移至100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，即為葡萄糖標準液。精確吸取標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于具塞試管中，分別補蒸餾水至1 mL，再各加入5 %的苯酚水溶液1 mL和濃硫酸5 mL振蕩搖勻，先在沸水浴中15 min，取出后立即置于冰水浴中15 min。以加入0 mL葡萄糖標準液的反應液作為空白對照調零，于490 nm下測各反應液的吸光度值，回歸分析數據。

1.2.4菌絲干重和EPS產量的測定

用抽濾法[11]將菌絲和發酵液分離，將濾紙和菌絲置于70℃的烘箱烘至干燥后稱量，除去濾紙干重即為菌絲干重。

菌絲體含量（g/L）=菌絲干重（g）/發酵液體積（mL）×1 000

把發酵液濃縮后加入4倍乙醇，置于4℃冰箱過夜處理，第2天把處理液放在轉速為10 000 r/min離心機中離心15 min后棄去上清，用蒸餾水溶解沉淀定容至250 mL，然后用苯酚硫酸法[12]測發酵液中的多糖含量。

1.2.5最適生長周期的確定

將楊樹桑黃培養14 d，每隔2天測定其菌絲干重和EPS產量。

1.2.6單因素試驗確定最佳搖瓶培養條件

碳源優化試驗：分別用30 g/L的果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖代替基礎培養基中的葡萄糖，26℃、160 r/min培養，測其菌絲干重和胞外多糖產量。

氮源優化試驗：采用以上的基礎培養基，分別以3 g/L牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3為氮源，26℃、160 r/min培養，測其菌絲干重和胞外多糖產量。

無機鹽優化試驗：在基礎培養基中分別添加5 mmol/L的MgSO4、KH2PO4、CuSO4、NaCl、CaCl2、FeSO4，以不加無機鹽的為空白，26℃、160 r/min培養，測其菌絲干重和胞外多糖產量。

pH試驗：使用1 mol/L的HCl和NaOH調節培養液pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10，26℃，160 r/min培養，測其菌絲干重和EPS產量。

溫度試驗：將接種好的培養基分別置于24、26、28、30、32℃搖床中，160 r/min培養，測定不同溫度條件下楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產量。

1.2.7正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗確定楊樹桑黃在搖瓶培養中獲得最高EPS產量的條件。為了綜合確定培養基中碳源、氮源和無機鹽的最佳濃度組合，本試驗設計了L9（34）正交表，各因素和水平詳見表1。

表1正交試驗的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.8形態學研究

每兩天取一次優化培養基中的菌絲球，顯微鏡下拍攝菌絲球形態后，通過DT2000圖像分析軟件分析，根據菌絲球的平均直徑、菌核面積、菌絲球面積、菌絲球周長、圓度等參數計算出緊密度、粗糙度。公式如下所示：緊密度=菌核面積/菌絲球面積；粗糙度=（菌絲球的周長）2/（菌絲球面積×4）[13]。菌絲球染色時，先加入與發酵液等體積的固定劑和少許染色劑，4℃冰箱放置1 d，然后用蒸餾水多次沖洗染色的菌絲體，將其放在載玻片上，待晾干后在40倍下顯微拍照。

2試驗結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

以葡萄糖濃度對吸光度的影響變化繪制標準曲線，回歸方程為y = 8.428 33x - 0.055 6，相關系數R2= 0.999 3。葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2最適生長周期的確定

在培養時間內，每2天測量一次楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產量，用sigmaplot軟件做圖。培養時間對楊樹桑黃菌絲干重和EPS產量的影響見圖2。隨著培養時間的增加，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產量均有所增長，但第8天以后菌絲干重仍在增加，而EPS產量明顯下降，這可能是由于菌絲量達到一定生長高峰期后，多糖成分作為養分供應菌絲增長而被消耗[14]。綜合考慮，確定楊樹桑黃的生長周期為8 d，此時胞外多糖的產量最高。

2.3最佳碳源的優化

碳源對楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產量均有顯著影響，結果如圖3所示。

圖2培養時間對楊樹桑黃菌絲干重和EPS產量的影響Fig.2 Effect of culture time on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

圖3碳源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產量的影響Fig.3 Effect of carbon source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

楊黃對葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖的利用率均較好，以葡萄糖為碳源時菌絲生物量最高，但EPS產量低于蔗糖的，綜合考慮，確定最佳碳源為蔗糖。

2.4最佳氮源的優化

氮源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產量的影響見圖4。

圖4氮源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

由圖4可以得出，以玉米粉為氮源時，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產量均達到最大值，其次是酵母粉，且一般無機氮源不利于菌株的生長，有機氮源利于菌株的生長和胞外多糖的積累[15]。綜合考慮，確定最佳氮源為玉米粉[16]。

2.5最佳無機鹽的優化

培養基中添加不同的無機鹽，目的為了增加菌絲干重和EPS產量。無機鹽對楊樹桑黃菌絲干重及胞外多糖產量的影響見圖5。

圖5無機鹽對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產量的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，添加無機鹽較沒有添加的多糖產量高，菌絲干重沒有明顯變化。添加MgSO4時楊樹桑黃的菌絲生物量達到最大，但添加KH2PO4時，EPS產量顯著增加，故選擇KH2PO4作為最適宜生長的無機鹽添加應用。

2.6最適培養溫度的優化

選取5個溫度梯度，24、26、28、30、32℃進行發酵培養，測菌絲干重和EPS產量，結果見圖6。

圖6培養溫度對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產量的影響Fig.6 Effect of culture temperature on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，26℃時楊樹桑黃的菌絲產量最高，28℃~ 32℃菌絲干重沒有明顯的變化。而EPS產量在28℃時增加至最大值，以目標產物為指標，選取28℃為最佳培養溫度。

2.7培養基初始pH的優化

培養基中pH的變化對營養物質的吸收與利用、細胞的生長、EPS產量都有著很大的影響。以液體種子培養基為基礎培養基，其他條件保持不變，培養基pH分別為3、4、5、6、7、8，進行發酵培養，確定最適pH，結果見圖7。

圖7培養基初始pH對楊黃菌絲干重及EPS產量的影響Fig.7 Effect of medium initial pH on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，楊樹桑黃菌絲生長的最適pH為6.0，產胞外多糖的最適pH為7.0。

2.8正交試驗

根據單因素試驗結果，碳源選擇蔗糖，氮源選擇玉米粉，無機鹽選擇KH2PO4，進行正交試驗考察，結果見表2。

表2楊樹桑黃正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of Phellinus vaninii Ljup

分析表2可知，以菌絲干重和EPS產量為指標，影響因素的主次順序均為A＞C＞B，最優組合為A3C1B3。表2 的9組試驗組合中沒有最優組合為A3C1B3，因此選擇該組合進行追加驗證試驗，獲得最佳條件下的胞外多糖產量為0.352g/L。楊樹桑黃的最優培養基組合為40g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。

2.9形態學

在優化培養基中，不同發酵時間的楊黃菌絲球形態變化和菌絲球平均直徑、圓度、緊密度和粗糙度的變化見圖8和圖9。

圖8楊樹桑黃隨發酵時間的形態變化（放大倍數40）Fig.8 The morphological changes of Phellinus vaninii Ljup during fermentation time（magnification 40）

圖9楊樹桑黃的形態學指標Fig.9 The morphological indexs of Phellinus vaninii Ljup

由圖8可以看到，隨著培養時間的增加，菌絲球逐漸增大，第2天已有明顯的菌核，外圍菌絲持續生長。到第6天菌絲生長最旺盛，發酵后期菌核較為致密，菌絲逐漸減少，這可能是由于發酵后期，菌絲生長到了穩定期。菌絲球的直徑和緊密度隨著時間的延長均逐漸增加（圖9A和9C），圓度呈先增加后減小的趨勢，初期圓度小可能與發酵初期菌絲球為絲狀體有關，隨著發酵時間的增加，外圍菌絲增加圓度急劇下降（圖9B）。菌絲球的粗糙度（圖9D）先減小后增加，與圓度呈負相關。

3　結論

本研究結果表明：楊樹桑黃產胞外多糖的最優環境條件為溫度28℃、pH 7、搖床轉速160 r/min，最適生長周期為8 d，最佳碳源、氮源和無機鹽分別是蔗糖、玉米粉和KH2PO4。正交試驗優化的最佳培養基組合為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4，獲得的胞外多糖產量為0.352 g/L。優化培養基中，菌絲球隨著培養時間的延長逐漸增大，其平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負相

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Optimization of Fermentation Conditions for Exopolysaccharide from Phellinus vaninii Ljup and Its Morphological Investigation

HE Pei-xin，WU Shuang-shuang，XU Chun-ping*
（College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China）

Abstract：In this study，the single-factor method and orthogonal design were used to optimize the flask culture conditions for exopolysaccharide（EPS）production by Phellinus vaninii Ljup. The morphological changes in optimal medium mycelia were also investigated. The results of single-factor experiment for EPS production showed the optimum growth cycle 8 days. And the best carbon source，nitrogen source and inorganic salts were sucrose，corn steep powder and KH2PO4，the optimal temperature of 28℃，pH 7. Then，the concentrations of three factors，i.e. carbon source，nitrogen source and inorganic salts was optimized using the orthogonal design and the optimum culture medium for EPS production were 40 g/L sucrose，4 g/L corn steep powder，4 mmol/L KH2PO4. Under the optimial culture conditions，EPS yield was 0.352 g/L. The morphology under the optimal medium was invesitaged during the fermentation period. The mycelial pellets increased gradually，and the average diameter and density also increased，but roundness increased first then decreases sharply. The roughness first decreased and then increased，which was negatively correlated with roundness.

Key words：Phellinus vaninii Ljup；optimization；exopolysaccharide；morphology

收稿日期：2014-08-02

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.044

*通信作者

作者簡介：何培新（1970—），男（漢），教授，博士，主要從事應用真菌的研究。

基金項目：國家自然科學基金（21376227）；河南省科技創新杰出青年計劃（134100510017）