GABA高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及誘變選育

鄭鴻雁，趙煒彤，昌妍希，邙巍（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春08；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特0000；.吉林省德惠市朱城子鎮(zhèn)人民政府，吉林德惠000）

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GABA高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及誘變選育

鄭鴻雁1，趙煒彤1，昌妍希2，邙巍3
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010100；3.吉林省德惠市朱城子鎮(zhèn)人民政府，吉林德惠130300）

摘要：從火龍果果實(shí)表面上篩選出一株發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA）白色菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和18S rDNA測(cè)序分析，鑒定為假絲酵母菌菌株（Candida.sp），命名為C2。C2作為出發(fā)菌株，分別采用紫外線（UV）和亞硝基胍（NTG）誘變方法選育高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株。與出發(fā)菌株相比，紫外誘變菌株γ-氨基丁酸產(chǎn)量增加了40.25 %，亞硝基胍誘變菌株γ-氨基丁酸產(chǎn)量增加了62.83 %。通過(guò)紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，得到正向突變株，其中Y6突變株遺傳性狀穩(wěn)定，γ-氨基丁酸產(chǎn)量達(dá)2.561g/L，產(chǎn)量比誘變前提高了3.1倍。

關(guān)鍵詞：γ-氨基丁酸；假絲酵母；紫外線；亞硝基胍；復(fù)合誘變

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，分布非常廣泛，在動(dòng)物、植物和微生物中均有GABA存在[1-3]。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[4]，具有許多重要的生理功能如降血壓[5]、安定神經(jīng)[6]、增強(qiáng)記憶[7]、抗焦慮[8]，尤其對(duì)更年期的失眠、壓抑和自身失調(diào)療效顯著[9]。隨著γ-氨基丁酸的生理功能不斷研究和闡明，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子，正逐漸應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)等行業(yè)[10-12]。2009年衛(wèi)生部批準(zhǔn)γ-氨基丁酸作為新資源食品用于食品生產(chǎn)加工[13]。我國(guó)在GABA類食品的研究開(kāi)發(fā)上與日本等發(fā)達(dá)國(guó)家相比落后很多，目前僅僅處于研究的初級(jí)階段[14]。GABA生產(chǎn)有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和植物富集法[15]。通過(guò)微生物發(fā)酵的方法有安全性高、生產(chǎn)成本較低和對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)[16]。菌株的生產(chǎn)能力可通過(guò)突變方式大幅度提高。相比單獨(dú)一種誘變方法，復(fù)合誘變能有效改變菌株對(duì)誘變因素的敏感性，提高正向突變率，具有大規(guī)模提高生產(chǎn)菌株產(chǎn)量的潛力[17-18]。

本研究從火龍果表皮分離篩選出一株GABA較高產(chǎn)亮的C2菌株，經(jīng)鑒定為假絲酵母（Candida.sp）。通過(guò)紫外線和亞硝基胍對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，選育出一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌菌株，對(duì)于γ-氨基丁酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

菌株來(lái)源：從草莓、火龍果、葡萄等水果表皮分離篩選能產(chǎn)生GABA的酵母菌菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

1）酵母合成培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母提取物5 g，蛋白陳10 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6.0。2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6.0。3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物1 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，L-谷氨酸5 g，pH 6.0。4）種子培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eSO4·H2O 0.01 g，MgSO4·H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.1.3主要儀器及試劑

UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；Z-36HK型高速低溫冷凍離心機(jī)：德國(guó)HERMLE；標(biāo)準(zhǔn)γ-氨基丁酸：上海楷洋生物技術(shù)有限公司；亞硝基胍：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；LC-20A型高效液相色譜儀（SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-20AT泵，CTO-10AS VP柱溫箱，LC-solution工作站）：日本Shimadzu。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)GABA菌株篩選

將各種樣品稀釋涂布于酵母合成培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落劃線純化得到酵母菌純菌株，進(jìn)行編號(hào)。將菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用薄層層析法篩選出產(chǎn)GABA菌株。再通過(guò)反相高效液相色譜法進(jìn)行GABA定量測(cè)定，挑選出一株高產(chǎn)GABA菌株，進(jìn)行鑒定。

1.2.2產(chǎn)GABA菌種鑒定方法

根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)方法對(duì)高產(chǎn)GABA的菌株進(jìn)行鑒定。將菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)，美藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[19]。分子生物學(xué)鑒定：18S rDNA測(cè)序（上海生工生物工程公司）；運(yùn)用BLAST搜索同源序列，應(yīng)用Mega5.3建樹(shù)，鑒定菌株。

1.2.3 γ-氨基丁酸定性測(cè)定

采用薄層層析法。按0.4 %的比例將顯色劑茚三酮加入展開(kāi)劑中，展開(kāi)劑組成體積比為：正丁醇∶冰醋酸∶水= 4∶2∶1。將發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min取上清液同1 g/L標(biāo)準(zhǔn)γ-氨基丁酸溶液點(diǎn)樣，展開(kāi)后80℃顯色20 min。

1.2.4 γ-氨基丁酸含量的測(cè)定

用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生紫外檢測(cè)反相高效液相色譜測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量。液相色譜條件：色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）。流動(dòng)相：流動(dòng)相A為25 mmol/L的乙酸鈉，用4 %的乙酸調(diào)pH至5.90；流動(dòng)相B為純乙腈。流速為1 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：332 nm。取發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min取上清液，稀釋到一定濃度。發(fā)酵液20 μL于樣品瓶中，加入OPA衍生液100 μL，渦旋振蕩5 s，靜置2 min后，過(guò)0.45 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣。定量采用GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=8.9E+7X+1155.9，回歸系數(shù)R2=0.999 8。采用HPLC檢測(cè)GABA所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成GABA產(chǎn)量。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.2.5菌懸液的制備

將在種子培養(yǎng)基中28℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體離心收集，并用0.9 %的無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，重懸于生理鹽水中，調(diào)整菌液濃度約為108CFU/mL，制成菌懸液[20]。

1.2.6紫外誘變

紫外燈預(yù)熱30 min后，取5 mL菌懸液放置在培養(yǎng)皿中，并將其放入磁力攪拌器上，在20 W紫外燈下距離20 cm照射一定時(shí)間。然后用無(wú)菌水稀釋成10-4、10-5、10-6濃度，分別取0.1 mL涂平板。將涂好的平皿置于28℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)好后從平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并測(cè)定其γ-氨基丁酸產(chǎn)量。采用3輪照射法進(jìn)行誘變。每次試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果都采用3個(gè)平行組，測(cè)試結(jié)果為各重復(fù)樣的平均值。

1.2.7亞硝基胍誘變

取一定量的菌懸液，加入0.8 mg/mL亞硝基胍溶液。28℃下分別振蕩反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min。立即于5 000 r/min室溫離心10 min。取沉淀用PBS洗滌3次后，溶于無(wú)菌水中，各取0.1 mL菌懸液進(jìn)行稀釋分離，涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)72 h，計(jì)算致死率。在確定了NTG處理時(shí)間后，再取菌懸液0.5 mL分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的亞硝基胍溶液28℃下振蕩，計(jì)算致死率，確定NTG的最佳濃度。從平板上選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-氨基丁酸產(chǎn)量。每次試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果都采用3個(gè)平行組，測(cè)試結(jié)果為各重復(fù)樣的平均值。

1.2.8復(fù)合誘變

先將菌懸液在20 W紫外燈下距離20 cm照射一定時(shí)間，然后將誘變后的菌液用一定濃度的亞硝基胍28℃處理一定時(shí)間。將亞硝基胍處理過(guò)的菌體離心，用PBS沖洗3次以除去殘留的亞硝基胍，然后使菌體轉(zhuǎn)移到100 mL種子培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24 h，最后將菌懸液稀釋到合適稀釋度，涂布于平板上，28℃培養(yǎng)72 h，計(jì)算致死率。從平板上選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-氨基丁酸產(chǎn)量。總共進(jìn)行3輪復(fù)合誘變。每次試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果都采用3個(gè)平行組，測(cè)試結(jié)果為各重復(fù)樣的平均值。

致死率的計(jì)算如下公式：

1.3遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

選取誘變后得到的γ-氨基丁酸產(chǎn)量較高的變異菌株連續(xù)傳代8次，每代分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其含量，含量穩(wěn)定的則其遺傳性能穩(wěn)定。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)GABA菌株的篩選

通過(guò)酵母合成培養(yǎng)基分離培養(yǎng)出32株菌。通過(guò)薄層層析檢測(cè)，篩選得到產(chǎn)GABA菌株共有3株。選取產(chǎn)GABA最高含量為0.8g/L的一株菌株進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。圖1為發(fā)酵液中GABA薄層層析檢測(cè)結(jié)果。

圖1薄層層析檢測(cè)結(jié)果Fig.1 TLC test results

2.2產(chǎn)GABA菌株的鑒定

菌體形態(tài)如圖2所示，呈橢圓形，美蘭染色呈藍(lán)色。菌落形態(tài)如圖3所示，菌落表面光滑，呈乳白色。生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過(guò)對(duì)菌株的基因序列分析，擴(kuò)增18S rDNA序列長(zhǎng)為1 278 bp。圖4為電泳圖。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)菌株序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，菌株與Candida. sp.同源性達(dá)100 %。建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示。結(jié)合菌株形態(tài)特征以及生理學(xué)特征初步鑒定該菌為Candida.sp，命名為C2。

菌體形態(tài)如圖2所示。

圖2菌體形態(tài)Fig.2 Cell morphology

菌落形態(tài)如圖3所示。

圖3菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology

酵母菌C2的生理生化特征如表2所示。

表2酵母菌C2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of C2 yeast strain

C2菌株的18SrDNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖見(jiàn)圖4。

圖4 C2菌株的18S rDNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4 C2 strain PCR amplification of 18S rDNA sequences electrophoresis

C2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示。

圖5 C2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 C2 Strain phylogenetic tree

2.3紫外誘變最佳誘變時(shí)間的確定

紫外線照射時(shí)間對(duì)菌株的致死率關(guān)系曲線如圖6所示。

圖6紫外線照射時(shí)間對(duì)菌株的致死率關(guān)系曲線Fig.6 Lethal rate curve of the strain on UV irradiation time

從圖6可知，紫外線照射時(shí)間對(duì)菌株致死率影響較大。按照誘變劑量選擇的一般原則，采用致死率為70 %~80 %的劑量。用紫外線處理50 s時(shí)致死率為75 %，選取50 s為最佳誘變時(shí)間。

2.3.1紫外線誘變突變株的篩選

以最佳誘變劑量50 s對(duì)初始菌株作誘變處理。經(jīng)初篩后，選40株突變株進(jìn)行復(fù)篩，其中12株產(chǎn)γ-氨基丁酸的含量較高，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，菌株UV15、UV28、UV34、UV40產(chǎn)γ-氨基丁酸量較高，其中UV28產(chǎn)γ氨基丁酸的量較原始菌株提高了40.25 %。連續(xù)傳代5次產(chǎn)量基本穩(wěn)定，可作為下一步誘變的出發(fā)菌株。紫外誘變突變株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸產(chǎn)量見(jiàn)表3。

表3紫外誘變突變株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸產(chǎn)量Table 3 GABA production of mutant strains by UV

2.4亞硝基胍誘變誘變劑濃度的確定

不同濃度亞硝基胍誘變菌株的致死率如圖7所示。

圖7不同濃度亞硝基胍誘變對(duì)菌株的致死率關(guān)系曲線Fig.7 Lethal rate curve of the strain on NTG concentration

隨著誘變劑濃度的增大，致死率不斷上升。當(dāng)亞硝基胍濃度為1.4 mg/mL時(shí)，致死率達(dá)100 %；用0.8 mg/mL亞硝基胍誘變菌株時(shí)，致死率為74 %，符合目的致死率。因此在亞硝基胍誘變中選擇亞硝基胍濃度為0.8 mg/mL。

2.5亞硝基胍誘變處理時(shí)間的確定

亞硝基胍處理時(shí)間對(duì)菌株的致死率影響見(jiàn)圖8。

圖8亞硝基胍處理時(shí)間對(duì)菌株的致死率關(guān)系曲線Fig.8 Lethal rate curve of the strain on Processing time by NTG

隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率不斷上升。當(dāng)誘變時(shí)間為30 min時(shí)，致死率達(dá)100 %；誘變時(shí)間為15 min時(shí)，致死率為78 %。由于酵母菌的致死率為75 %~80 %時(shí)誘變作用最為明顯，菌株發(fā)生正向突變的幾率最高，因此確定亞硝基胍處理時(shí)間為15 min。

2.6亞硝基胍誘變突變株的篩選

以0.8 mg/mL的NTG為最佳誘變濃度對(duì)菌株UV28誘變處理15 min。將誘變所得的50株突變株，利用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，篩選出γ-氨基丁酸產(chǎn)量較高的6株突變菌，其γ-氨基丁酸含量如表4所示。

將突變株NTG17與突變株NTG20分別轉(zhuǎn)接5代，發(fā)現(xiàn)突變株NTG17的遺傳穩(wěn)定性較好，產(chǎn)γ-氨基丁酸的量較突變株UV28提高了40.28 %。確定將它作為復(fù)合誘變的出發(fā)菌株。亞硝基胍誘變突變株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸產(chǎn)量見(jiàn)表4。

表4亞硝基胍誘變突變株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸產(chǎn)量Table 4 GABA production of mutant strains by NTG

2.7紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變的結(jié)果

以最佳紫外誘變劑量和最佳亞硝基胍誘變劑量對(duì)突變株NTG17進(jìn)行3輪復(fù)合誘變，得到4株產(chǎn)γ-氨基丁酸量較高的菌株，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5復(fù)合誘變突變株發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸產(chǎn)量Table 5 GABA production of mutant strains by compound mutation

其中突變株Y6產(chǎn)γ-氨基丁酸的量最高，產(chǎn)γ-氨基丁酸的量較突變株NTG17提高了62.83 %。因此選取突變株Y6為γ-氨基丁酸的高產(chǎn)菌株。

2.8突變株Y6傳代試驗(yàn)

對(duì)菌株Y6連續(xù)傳代培養(yǎng)8次，測(cè)定γ-氨基丁酸產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知突變株Y6的γ-氨基丁酸產(chǎn)量穩(wěn)定，說(shuō)明該突變株Y6遺傳穩(wěn)定性較好。

2.9 HPLC測(cè)定GABA結(jié)果

圖9（a）為不添加GABA的空白衍生劑色譜圖，圖9（b）為GABA標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖，對(duì)比可見(jiàn)，GABA的保留時(shí)間為17.1 min左右。圖9（c）為發(fā)酵液色譜圖。采用HPLC檢測(cè)法可準(zhǔn)確的測(cè)定出GABA產(chǎn)量。

表6突變株遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定Table 6 Genetic stability test of the mutant strain

圖9高效液相色譜圖Fig.9 HPLC chromatograms

3　結(jié)論

本研究通過(guò)初篩、復(fù)篩獲得了一株γ-氨基丁酸產(chǎn)量較高的菌種，采用高效液相色譜法對(duì)γ-氨基丁酸樣品進(jìn)行了快速準(zhǔn)確的定性分析，并根據(jù)形態(tài)、生理生化試驗(yàn)以及18SrDNA序列分析初步鑒定出該γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌株為假絲酵母Candida.sp。分別采用紫外線和亞硝基胍對(duì)C2菌株誘變，確定紫外線和亞硝基胍誘變條件為：紫外照射50 s，亞硝基胍濃度0.8 mg/mL，亞硝基胍處理時(shí)間15 min，經(jīng)過(guò)多輪誘變和篩選，得到遺傳穩(wěn)定性較好的Y6突變株，γ-氨基丁酸產(chǎn)量最高為2.561g/L，是出發(fā)菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的約3.1倍。目前生物合成γ-氨基丁酸的酵母菌國(guó)內(nèi)外研究很少，Takahashi等從日本米酒中篩選到一株釀酒酵母，發(fā)酵液中γ-氨基丁酸濃度約為0.42 mmol/L[21]。試驗(yàn)所篩選的高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株對(duì)研究γ-氨基丁酸具有重要的實(shí)踐意義，為今后研究γ-氨基丁酸保健產(chǎn)品提供一定的理論參考價(jià)值。

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Sceening and Indentifiacation and Mutagenesis of High-yielding Strains for Producing GABA

ZHENG Hong-yan1，ZHAO Wei-tong1，CHANG Yan-xi2，MANG Wei3
（1. Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2. Pharmacy College，Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010100，Inner Mongolia，China；3. People's Government of Dehui City，Jilin Province，Dehui 130300，Jilin，China）

Abstract：White strains producing γ-aminobutyric acid（GABA）were screening from the surface of pitaya fruits. Strains named C2 were identified as Candida.sp by morphological observation，physiological and biochemical characteristics and 18SrDNA sequence analysis.C2 as the starting strain was screened by UV and NTG to get high-yield of γ-aminobutyric acid yeast. Compared with the starting strain，the data showed that the increasing rate of γ-aminobutyric acid production was 40.25 %from a strain by UV mutagenesis and 62.83 % from a strain by NTG mutagenesis.Y6 with stable γ-aminobutyric acid production was obtainded by UV combined with NTG.The γ-aminobutyric acid production from Y6 was 2.561 g/L and increased about 3.1 times than that before mutagenesis.

Key words：γ-aminobutyric acid；Candida.sp；UV；NTG；composite mutagenesis

收稿日期：2014-09-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.045

作者簡(jiǎn)介：鄭鴻雁（1968—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：功能食品、微生物菌種篩選及發(fā)酵工藝。