米曲霉氨基酰化酶的純化及粗酶性質研究

張媛媛，張彬（石家莊學院化工學院，河北石家莊050035）

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米曲霉氨基酰化酶的純化及粗酶性質研究

張媛媛，張彬
（石家莊學院化工學院，河北石家莊050035）

摘要：利用硫酸銨分級鹽析法從米曲霉L-09中提取氨基?；?，比活力為56.01 U/mg，純化倍數為2.06，酶活力回收率為80 %。詳細研究該粗酶的酶學性質。結果表明，經鹽析法提純的粗酶最適pH為7，最適反應溫度為55℃，在55℃下熱穩定性良好。溶液中的金屬離子對酶活力有很大影響。其中，高濃度的Fe2+、Mn2+和Ca2+對酶活力有抑制作用，低濃度的Co2+離子對酶活力有激活作用。

關鍵詞：氨基?；?；純化；粗酶性質

氨基酸作為一種常見的手性化合物，其生產、應用與人類息息相關。D-氨基酸如D-丙氨酸[1]，D-苯丙氨酸[2]因其重要的生理功能，在醫藥、食品等行業中都有較好的潛在價值[3]。但D-氨基酸在自然界中含量稀少，直接提取的成本較高，也無法通過發酵法獲得，因此使用氨基酰化酶對D，L-氨基酸進行酶學拆分是生產D-氨基酸的行之有效的方法之一[4]。

氨基?；改軐Ｒ坏厮釴-?；?L-氨基酸的酰胺鍵，獲得L-氨基酸，反應物中留下的D-氨基酸可通過化學方法轉型或繼續拆分[5]。氨基酰化酶廣泛存在于動物[6]、植物[7]和微生物細胞[8]中，米曲霉氨基酰化酶是由米曲霉產生的胞外酶。

自60年代末日本將固定化氨基?；赋晒糜谏a以來，國內有關于該酶固定化的研究報道很多[9-10]。受成本限制固定化氨基?；傅某霭l酶液通常采用鹽析等蛋白質初級純化方法進行處理，所以研究經初步純化后的粗酶液的酶學性質對于后續的固定化操作有很大意義。本文以米曲霉L-09為出發菌，詳細研究了經鹽析法初步純化后的氨基?；复置敢旱拿笇W性質，為該酶的固定化操作提供了更確切的參考。

1材料和方法

1.1菌種

米曲霉L-09：石家莊學院食品科學實驗室選育保藏。

1.2培養基

1.2.1黃豆汁瓊脂培養基

豆汁200 mL（20 g黃豆加水200 mL浸提過夜，煮沸2 h，用紗布過濾即可），蔗糖6 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO40.072 g，瓊脂4 g，pH自然。

1.2.2固體培養基

麩皮∶豆餅粉∶水= 4∶1∶5；吐溫-80 0.5 %；植酸0.05 %，以上均為質量比；pH自然。

1.3主要原料及儀器

N-乙酰-DL-蛋氨酸（N-AC-DL-Met），純度99 %：購于江蘇省張家港市氨基酸有限公司；721型分光光度計：島津有限公司；H.H.S型電熱恒溫水浴鍋：鄭州市鞏義華玉儀器廠；SHZ_DⅢ型循環水真空泵：上海比朗儀器制造有限公司；冷凍高速離心機：湖南湘儀儀器有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.4方法

1.4.1米曲霉的固態培養

取1 mL的霉菌孢子懸液（106個/mL）接種到固態培養基內，于30℃，100 r/min的搖床上培養2 d。

1.4.2米曲霉氨基?；傅奶崛?/p>

取培養好的固體培養基若干，加入7倍于其質量的蒸餾水，于30℃，100 r/min的搖床上浸提1 h，紗布過濾、抽濾得到酶液。

1.4.3鹽析法純化米曲霉氨基?；?/p>

向酶液中緩慢添加研細的固體（NH4）2SO4，使溶液中的（NH4）2SO4達到一定的飽和度，4℃靜置2 h，10 000 r/min冷凍離心15 min，所得沉淀用磷酸緩沖液溶解，透析除鹽并測定酶活。在添加（NH4）2SO4的同時要注意攪拌均勻，防止局部鹽濃度過高，引起酶蛋白變性。

1.4.4酶活力測定方法

取0.2 mL待測酶液于試管中，依次加入0.4 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，0.2 mL（0.15 mmol/L）CoCl2，0.2 mL（0.2mol/L）N-AC-DL-Met，37℃恒溫水浴30min，迅速取出，沸水浴5 min滅酶，待冷卻后加入1 mL pH 5.4的NaAc-HAc緩沖液，0.5 mL茚三酮顯色劑，沸水浴15 min，冷卻，加入3 mL 60 %（體積分數）的乙醇溶液，在570 nm下比色，得到吸光度值，并由標準曲線計算出待測酶液中蛋氨酸的含量。對照溶液先滅酶，再加入底物N-AC-DL-Met，其余同上。

酶活力單位（U）定義為：在pH 7.0和37℃下，1 h內酶催化底物水解釋放出1 μmol L-蛋氨酸為1 U。

1.4.5蛋白的測定方法

考馬斯亮蘭法[11]。

2結果與討論

2.1鹽析中（NH4）2SO4飽和度的確定

2.1.1一級鹽析（NH4）2SO4飽和度的確定

向酶液中添加不同質量的（NH4）2SO4，使其在酶液中的飽和度分別達到20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %。得到沉淀中的酶活力回收率與（NH4）2SO4飽和度之間的關系如圖1所示。

圖1不同（NH4）2SO4飽和度對氨基?；该富盍厥章实挠绊慒ig.1 Effect of saturation of ammonium sulfate on recovery rate of aminoacylase

從圖中看出，當（NH4）2SO4飽和度為30 %時，僅有不到10 %的酶活力保留在沉淀中；當飽和度大于60 %時，沉淀中的酶活力回收率都較高。因此，一級鹽析選用的（NH4）2SO4飽和度為30 %。

酶活力回收率/% =（純化后總酶活力/純化前總酶活力）×100

2.1.2二級鹽析（NH4）2SO4飽和度的確定

去除30 %（NH4）2SO4飽和度沉淀后，上清液中繼續添加（NH4）2SO4，使飽和度分別達到60 %、70 %和80 %。所得結果見表1。

表1（NH4）2SO4二次鹽析試驗結果Table 1 Result of the second salting-out of ammonium sulfate

從表1中看出，（NH4）2SO4飽和度為70 %時，酶活力回收率與80 %飽和度時相差不大，但是純化倍數高于80 %飽和度。因此，二級鹽析選用的（NH4）2SO4飽和度為70 %。

比活力=單位酶活力/蛋白質濃度；純化倍數=純化后的比活力/粗酶液的比活力

2.2粗酶酶學性質的研究

發酵法提取的氨基?；敢航涍^鹽析，透析和聚乙二醇濃縮后，就得到了可用于固定化研究的粗酶液。下面對此氨基?；复置敢旱拿笇W性質進行了研究。

2.2.1溫度對酶活力的影響

通過測定不同反應溫度下的酶活力，得到溫度對氨基?；杆饽芰Φ挠绊懀鐖D2所示（定義最大酶活力為100 %）。

從圖中看出，氨基?；冈?5℃時對底物NAC-DL-Met的水解能力最強。

圖2溫度對酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on aminoacylase activity

2.2.2熱穩定性研究

將粗酶液密閉于試管中，并將試管分別放置在37、50、55、60、65、70、80℃的水浴中保溫30 min，取出試管，在37℃下測定酶活力，結果見圖3（定義初始酶活力為100 %）。

圖3酶的熱穩定性曲線Fig.3 Thermal stability of the aminoacylase

從圖中看出，粗酶液在37℃下的熱穩定性良好，在70℃下放置30 min失活現象顯著。

對酶液在37℃和55℃下的熱穩定性進行了進一步的試驗研究，將粗酶液分別置于37℃和55℃水浴中放置8 h，間隔1 h測定其酶活力，結果如圖4所示（定義初始酶活力為100 %）。

圖4 37℃、55℃條件下酶的熱穩定性Fig.4 The thermal stability of the aminoacylase on the 37℃and 55℃condition

從試驗結果得知，粗酶液在55℃水浴中放置8 h，酶活力保留率在82 %以上；在37℃水浴中表現出更好的熱穩定性，放置8 h酶活力保留率仍在90 %以上；該酶2個溫度環境下均沒有明顯失活現象，表明其具有良好的熱穩定性。結合溫度對酶活力的影響試驗結果，在55℃下，該酶對底物N-AC-DL-Met的水解能力最強。實際應用過程中，在對酶的熱穩定性影響較小的前提下，可適當升高溫度，來提高酶促反應速度，以達到最佳反應效果。

2.2.3 pH對酶活力的影響

通過改變反應液的酸堿條件，得到酶活力與溶液pH之間的關系如圖5所示（定義最大酶活力為100%）。

圖5 pH對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on aminoacylase activity

由圖中看出，米曲霉氨基?；冈谥行院腿鯄A性的條件下對底物的水解能力較強，在pH 4時已基本失活，其最適pH為7.0。

2.2.4金屬離子對酶活力的影響

氨基?；甘且环N含Zn2＋的酶[12]，有2個金屬離子松散結合位點，可與二價金屬離子結合。而在工業生產中金屬離子的攝入是不可避免的，因此，研究了幾種常見金屬離子對粗酶液酶活力的影響，結果如表2所示。

表2金屬離子對酶活力的影響Table 2 Effect of metal ion on anmioacylase activity

從表2中可以看出，Mg2+、Zn2＋和Li＋對酶活力的影響不大，Cu2＋對酶活力有強的抑制作用，高濃度的Fe2＋、Mn2＋和Ca2＋對酶活力也有抑制作用，而低濃度的Co2+和Ca2＋對酶活力有激活作用。對Co2+和Ca2＋做進一步的研究，結果見圖6、圖7。

圖6 Co2+濃度對酶活力的影響Fig.6 Effect of ion of Co2+on aminoacylase activity

圖7 Ca2+濃度對酶活力的影響Fig.7 Effect of ion of Ca2+on aminoacylase activity

從圖中可以看出：Ca2+濃度在0.1 mmol/L~1 mmol/L之間時對酶活力有很強的激活作用，Ca2＋濃度在小于1 mmol/L時對酶活力也有激活作用，但效果不如前者顯著。

2.2.5酶的保存穩定研究

研究了粗酶液的保存穩定性。將酶液放置在4℃冰箱中保存，間歇測定酶液的殘留酶活力，得到酶活力與放置時間的關系曲線如圖8所示。

由圖8看出，當放置時間為30 d時，酶活力損失率僅為25 %，由公式t1/2=ln2/kd，CEt/CE0=e-kd×t。式中：t1/2為半衰期；CE0為初始酶活力；CEt為t時的相對酶活力；kd為衰變常數。計算出該粗酶液的半衰期為104 d。

3　結論

利用硫酸銨二級沉淀法獲得的粗酶液比活力為56.01 U/mg，純化倍數為2.06，酶活力回收率為80 %。該粗酶液的半衰期是104 d，最適pH為7.0，最適溫度為55℃，在55℃下熱穩定性良好。通過對熱穩定性和最適溫度的綜合比較看出，在熱穩定良好的時間范圍內，55℃下該酶的水解能力明顯優于37℃，即粗酶液的最佳使用溫度為55℃。因此，在游離酶及固定化酶的實際應用中可以根據反應條件、反應時間等具體情況，選取合適的反應溫度，以提高催化效率。

通過研究金屬離子對酶活力的影響得知，Cu2＋及高濃度的Fe2＋、Mn2＋和Ca2＋對酶活力有抑制作用，Co2+濃度在0.1 mmol/L~1 mmol/L之間及Ca2＋濃度小于10 mmol/L時均對酶活力有很強的激活作用，但后者效果不如前者顯著。因此在酶活力測定及實際生產應用中應該添加適量Co2+來提高酶活力，同時應盡量避免原料中對酶活力有抑制作用的金屬離子所帶來的負面影響。在使用海藻酸鈣對氨基?；高M行包埋固定化時應考慮到Ca2＋濃度對粗酶液酶活力的影響。

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Study on Purification and Properties of Aminoacylase of Aspergilus oryzae

ZHANG Yuan-yuan，ZHANG Bin
（Institute of Chemical Technology，Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

Abstract：The aminoacylase from Aspergillus oryzae was partially purified by ammonium sulfate fractionation. The specific activity of aminoacylase was 56.01 U/mg. The purification ratio and recovery were 2.06 and 80 %. The optimal pH of aminoacylase was 7.0. The optimal temperature of aminoacylase was 55℃. The thermal stability of aminoacylase under 55℃was good. The ions in the solvent infected the aminoacylase. Fe2+，Mn2+and Ca2+in high concentration lowered the activity of aminoacylase，the Co2+in low concentration activated the

aminoacylase.

Key words：aminoacylase；purification；properties

收稿日期：2014-10-13

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.046

作者簡介：張媛媛（1983—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：發酵工程，食品安全與食品分析。