甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發酵工藝優化

陳朝儒，王　智，馬　強，張麗娜，奚亞軍※，頓寶慶，李桂英，路　明，杜風光

（1.西北農林科技大學農學院，楊凌 712100；　2.中國農業科學院 作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程，北京 100081；　3.車用生物燃料技術國家重點實驗室，南陽 473000）

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甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發酵工藝優化

陳朝儒1,2，王智2，馬強1，張麗娜2，奚亞軍1※，頓寶慶2，李桂英2，路明2，杜風光3

（1.西北農林科技大學農學院，楊凌 712100；2.中國農業科學院 作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程，北京 100081；3.車用生物燃料技術國家重點實驗室，南陽 473000）

摘要：為了提高甜高粱秸稈乙醇生產中莖汁和莖渣的利用，以甜高粱莖汁及其渣為發酵原料，對莖汁莖渣混合原料同步糖化乙醇發酵的工藝條件進行優化研究。采用Plackett-Burman（PB）篩選設計試驗篩選出影響甜高粱莖稈渣汁同步糖化乙醇發酵的顯著因素。采用響應面法建立了同步糖化發酵乙醇生產的乙醇產量數學模型。根據該模型進行了工藝參數的優化，以乙醇產量為指標，試驗所得甜高粱莖稈渣汁同步糖化化乙醇發酵的優化工藝條件為：發酵溫度36.58℃，混合纖維素酶添加量=23.5 (FBU/mL)/35.25 (CBU/mL)，甜高粱渣汁質量體積比為8.2%，理論預測乙醇產量為89.2%，在此條件下進行驗證試驗，乙醇產量為88.98%，平均質量濃度，驗證了數學模型的有效性，為提高甜高粱莖汁及莖渣混合原料同步糖化發酵產乙醇和提高發酵效率提供參考。

關鍵詞：發酵；乙醇；優化；甜高粱莖汁；甜高粱莖渣：同步糖化發酵；響應面分析法

陳朝儒，王智，馬強，張麗娜，奚亞軍，頓寶慶，李桂英，路明，杜風光. 甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發酵工藝優化[J]. 農業工程學報，2016，32（3）：253－258.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037http://www.tcsae.org Chen Chaoru, Wang Zhi, Ma Qiang, Zhang Lina, Xi Yajun, Dun Baoqing, Li Guiying, Lu Ming, Du Fengguang. Optimization of ethanol production from bagasse and juice of sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(3): 253－258. (in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037http://www.tcsae.org

0　引　言

隨著化石日趨短缺，能源需求是二十一世紀面臨最大的挑戰之一[1]，這也同時促進了生物能源替代石油的研究和應用。傳統的乙醇生產工業發酵原料多為糧食或陳化糧。甜高粱[Sorghum bicolor (L). Moench]是一種非常有發展前景的非糧能源作物[2]，畝產4～5 t高糖分和纖維的秸稈[3]。而甜高粱莖汁所含糖分以及莖渣經處理后也可以進行乙醇發酵[4-5]，這樣不僅會提高甜高粱的綜合利用，還降低種植及生產成本[6-7]。

甜高粱作為一種重要的生物質能源植物，因為其莖稈富含非結構性碳水化合物（蔗糖、葡萄糖及果糖）和結構性碳水化合物（纖維素和半纖維素）[8]。甜高粱莖稈里的這些糖分比較容易乙醇發酵，通常采用液體發酵[9-10]和固態發酵[11-12]技術生產乙醇，而莖渣里含有與糖分大致相當的木質纖維素成分[13]。將這些莖渣也同時用于乙醇發酵是一個難點。而每公頃甜高粱經過發酵可生產無水乙醇5 800～6 500 L，比單位面積甘蔗生產的無水乙醇量高出20%～30%，對于保證糧食安全和制取燃料乙醇等方面都具有非常廣闊的發展前景[14-15]。

同步糖化發酵技術（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）是纖維素乙醇發酵工程領域的重要內容之一。SSF有利于水解產物及時被發酵微生物代謝為乙醇，消除糖對纖維素酶的抑制作用，它克服分步糖化過程中水解率低、設備利用率低以及發酵周期長等缺點[16]。據報道，成本可降低20%以上[17-18]。最重要的是這種工藝可提高乙醇產量，通?？杀确植教腔l酵增加40%[19]。SSF有很好的應用價值。

響應面法（response surface methodology，RSM）[20]已廣泛應用于生物酶生產、乙醇發酵的工藝優化[21-23]。目前，對甜高粱莖稈榨汁或渣分別進行乙醇發酵的響應面優化研究較多[24-26]，而且對莖渣都進行會造成環境污染和成本增加酸、堿或氣爆等預處理后再進行SSF發酵，但以甜高粱莖汁及粉碎的莖渣為原料，利用代謝木糖的重組釀酒酵母進行同步糖化發酵生產乙醇的優化工藝未見報道，代謝木糖的重組工業釀酒酵母能夠利用莖渣糖化第二大產物木糖發酵乙醇。為此，本研究以甜高粱莖汁和莖渣為原料，探索SSF發酵的可行性及最佳渣汁比例。以發酵溫度、纖維素酶添加量及甜高粱莖渣汁比為自變量，以甜高粱莖渣汁混合物同步糖化乙醇發酵過程中乙醇產量為響應值，利用Box-Behnken試驗設計，考察自變量與因變量之間的關系，并優化甜高粱莖汁莖渣混合SSF生產乙醇的工藝，為甜高粱莖稈生產燃料乙醇的提供新的工藝模式以及為甜高粱莖稈綜合利用的提供產業化模式。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1原料

甜高粱莖汁及莖渣：甜高莖稈于2012年10月17日采自于中國農業科學院作物科學研究所北京昌平實驗站，品種為M81E。莖稈于當日在該試驗站經SX300型榨汁機榨汁后，甜高粱莖稈榨取汁液經高溫高壓滅菌之后，4℃保存。測定莖稈汁液中的主要成分，莖渣用蒸餾水沖洗至中性，烘干干燥后粉碎至40目備用，甜高粱莖汁及莖渣基本成分測定結果見表1。

表1　甜高粱莖汁及莖渣成分Table1　Components of sweet sorghum juice

1.1.2糖化酶、菌種

纖維素酶：Novozymes NS 50013（酶活為70 FPU/mL）混合纖維素酶和Novozymes NS 50010 β-葡萄糖苷酶(酶活為250 CBU/mL)（北京諾維信（中國）有限公司）。

發酵菌種：實驗室構建的木糖代謝重組釀酒酵母RXI-T1308-U（尿嘧啶營養缺陷型），該菌株是以耐較高溫度及來高糖發酵的工業釀酒酵母T1308為出發菌株，通過基因同源重組構建的能夠代謝木糖發酵乙醇的工程菌。

1.1.3酵母培養基

種子培養基：酵母培養基YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，固體平板添加2%瓊脂）。

發酵培養基：甜高粱渣、莖稈汁液、(NH4)2SO45 g/L、KH2PO32 g/L、MgSO41 g/L、酵母提取物5 g/L。

1.2試驗儀器

粗纖維測定儀（FIWE 6型，意大利VELP公司），恒溫搖床（Escotron S-000114311型，瑞士伊孚森公司）；高壓滅菌鍋（MLS-3780型，日本三洋電機公司）；超凈工作臺（LAZ-4A1型，新加坡藝思高科技有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司）；高速萬能粉碎機（FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司）；立式壓榨機（SX300型，廣東佛山利寶達有限公司）；分析天平（AL204型，瑞士梅斯特-托利多集團）；高效液相色譜儀（Waters 2695型，北京科益恒達科技有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1莖渣及莖汁成分測定

甜高粱渣木質纖維素組分測定：范氏纖維素測定法。

甜高粱莖汁及發酵醪液中糖分測定：高效液相色譜法（HPLC），高效液相色譜儀WatersHPLCe2695，色譜柱Waters Sugar Park I（300 mm×6.5 mm）（Bio-Rad，USA），采用折光示差檢測器（Waters 2414）檢測。進樣量20 μL，柱溫80℃，流動相50 μg/L EDTA CaNa2，洗脫流速0.5 mL/min

1.3.2SSF流程

將60 mL滅菌后甜高粱汁液置于150 mL三角瓶中，于200 r/min條件下在恒溫搖床培養箱中連續發酵。

1.3.3乙醇濃度測定

取60 h發酵液，以HPLC測定發酵液乙醇濃度（見1.3.1節）。

1.4試驗設計

1.4.1PB試驗設計篩選影響乙醇產量的顯著因素

PB試驗設計：選擇影響甜高粱莖稈渣汁混合同步糖化發酵的8個因素（發酵溫度、糖化酶添加量、酵母接種量、pH值、甜高粱莖稈渣汁比、發酵時間、硫酸銨用量、尿嘧啶用量）作為變量，因為發酵菌株為尿嘧啶營養缺陷型，所以選擇尿嘧啶作為其中1個因素，其余因素是常見影響乙醇SSF的因素。增添3個虛擬變量，變量均取2水平，總變量為11個，響應值為乙醇產量（Y）。

1.4.2最陡爬坡試驗設計

根據PB試驗確定的顯著因素，設計最陡爬坡試驗，其余非顯著性因素保持原來的中心點水平，同時逐漸提高3個顯著因素實際水平，來分析它們對乙醇產量的影響（見表2）。

表2　爬坡試驗設計及試驗結果Table 2　Results and design of path of steepest ascent experiment

1.4.3響應面法（response surface methodology）混合發酵優化試驗設計

根據最陡爬坡試驗確定出響應面中心點及各個顯著因素的變化步長。根據Box-Behnken 中心組合設計原理設計了以溫度X1、酶添加量X2、渣汁比X5為自變量，每個因素取3個水平，以（?1，0，1）編碼試驗。響應面分析方法試驗因素編碼和水平見表3。對發酵溫度、酶添加量和渣汁比進行3因素3水平共17個點的響應面分析試驗。

表3　Box-Behnken試驗因素與水平表Table 3　Factors and levels of Box-Behnken test

1.4.4優化結果驗證試驗

根據響應面優化獲得的最佳參數條件進行驗證試驗，以驗證優化結果的準確性，本試驗只有一組處理，做3個重復試驗。

1.4.5數據處理及分析

所得數據用軟件Design Expert 8.0分析（P=0.05）。

2　結果與分析

2.1影響甜高粱莖稈渣汁同步糖化發酵因素的顯著性分析

PB設計的試驗結果進行的回歸分析表明，該PB試驗設計模型的決定系數R2為0.9690，校正決定系數Adj.R2為0.8863（表4）。對該PB模型進一步分析，發現發酵溫度（X1），酶添加量（X2）及甜高粱渣汁比（X5）對乙醇產量的影響最為顯著（P＜0.05），表明這3個因素為能有效提高乙醇產量。而其余因素無顯著影響，因此選擇3個顯著因素X1、X2及X5進一步進行優化試驗。

表4　PB設計回歸分析Table 4　Regression analysis of PB design

2.2釆用最陡爬坡試驗確定顯著因素的優化區域

對PB設計回歸分析確定的3個顯著因素（X1、X2、X5），設計最陡爬坡試驗，試驗設計及結果見表2。乙醇產量隨著3個因素的增加或升高表現出先升后降的趨勢。發酵的最優條件在試驗3的水平上，因此選擇該水平為響應面試驗中心點，其余非顯著性因素保持原來的中心點水平，同時逐漸提高3個顯著因素實際水平，來分析它們對乙醇產量的影響，這些因素的步長分別為：3℃、5FPU/5CBU、1.5%。

2.3響應面二次多項回歸模型的建立及檢驗

2.3.1二次項回歸方程的模型的建立及檢驗

對發酵溫度、酶添加量和渣汁比進行3因素3水平共17個點的響應面分析試驗結果見表5。

表5　Box-Behnken試驗設計及結果Table 5　Design and results of Box-Behnken experiment

利用Design Expert 8.05b軟件對Box-Behnken中心組合試驗結果（表4）進行二次多項回歸擬合，獲得發酵乙醇產率對溫度、纖維素酶添加量及甜高粱渣汁的多元二次回歸模型。

回歸擬合試驗數據，回歸方程為：

二次交互項X1X5作用不顯著（P=0.2946>0.05），去掉它的方程為：

式中Y為乙醇產量的理論預測值，從回歸模型方差分析結果（表6）可以看出，回歸模型顯著，P值小于0.0001，回歸方程的擬合度也非常好，R2=0.9987，這表明預測值和試驗值之間的相關性很高；模型P值<0.0001，模型失擬P 值=0.8719，表明該二次響應面回歸模型失擬不顯著，而回歸極顯著；由R2=0.9987、Adj. R2=0.9971及CV=0.0099，這些都表明該模型是可靠的，因此該回歸模型可用于甜高粱渣汁混合同步糖化發酵乙醇工藝的理論預測。

從模型回歸系數顯著性檢驗可以看出，對乙醇產量（Y）影響最大為：X2、X5、、以及X1X2；然后依次為：、X1及X2X5）；X1X5對乙醇產量（Y）的影響不顯著（P=0.2946>0.05）。

表6　BB試驗設計的回歸分析Table 6　Regression analysis of BB design

2.3.2混合發酵工藝參數交互作用的響應面分析

為了直觀展現甜高粱莖稈渣汁混合發酵顯著因素對發酵終產物乙醇產量的影響，二次三項回歸方程做出響應面圖（見圖1），它們分別直觀展示了2個重要顯著及其交互作用對產物乙醇產量的影響。

圖1　響應曲面分析Fig 1.　Response surface analysis

由發酵溫度和酶添加量的交互影響的響應面圖可知（圖1a），當甜高粱莖稈渣汁比處于中心水平7%時，發酵溫度和酶添加量交互作用極顯著。在溫度為編碼值?1～0之間（30～37℃），隨著酶添加量的增加，乙醇顯著增加；但酶添加量過高會導致酵母生長受底物影響，導致乙醇產量降低。提高發酵溫度，降低底物對酵母的抑制作用，乙醇產量增加。發酵溫度和酶添加量之間存在協同作用。當發酵溫度處于33.5～40.5℃范圍，酶添加量處于15FPU/22.5CBU～30FPU/45CBU范圍時，乙醇產量可以最大值。

由酶添加量和甜高粱莖稈渣汁比交互作用的響應面圖可知（圖1b），當發酵溫度處于中心水平37℃時，酶添加量與渣汁比交互作用顯著，在酶添加量較低水平時，乙醇濃度隨著渣汁比提高而增加，在高水平的酶添加量時，乙醇產量隨著渣汁比提高而先增加后下降。

2.3.3混合發酵工藝參數的優化驗證

對所得回歸擬合方程進行求解，可以得出模型的最優值，即最優的發酵工藝條件，即當溫度為36.58℃，酶添加量為23.5FBU/35.25CBU，甜高粱渣汁比為8.2%。以最優的發酵工藝條件，60 h發酵，甜高粱渣汁為培養基，測定重組菌株RXI-T1308-U利用甜高粱莖稈渣汁混合物同步糖化發酵乙醇的能力，3次重復，獲得的平均平均乙醇產量為88.98%，獲得的平均乙醇質量濃度為31.78 g/L，與模型乙醇產量89.20%無顯著性差異（P＞0.05）質量濃度31.829 g/L，試驗值非常接近理論最大值，說明該模型比較真實地反應出各個篩選因素對乙醇濃度的影響，較好地預測實際同步糖化發酵情況，也證明了響應面優化甜高粱莖稈渣汁混合同步糖化乙醇發酵的的可行性。

3　討　論

一般對于發酵工藝的優化多采取單因素法，但是這會增加工作量而且試驗周期也長，采用2水平的PB設計可以從多因素中快速高效地確定對發酵結果產生顯著影響的重要因素，以確定的顯著因素進一步進行響應面優化分析，通過分析得到最佳條件。為了充分利用甜高粱莖稈汁液及莖渣來提高發酵產物乙醇的產量，同時不對莖渣以傳統的會造成環境污染的酸或堿預處理，以及高成本的汽爆預處理，而直接以粉碎的甜高粱莖稈渣汁為原料，采用同步糖化發酵工藝，利用PB及BB設計和響應面分析對甜高粱渣汁同步糖化發酵工藝進行優化，發現主要影響因素為發酵溫度、糖化酶添加量及渣汁比；發酵溫度和酶添加量，酶添加量和渣汁比均對乙醇產量有顯著的交互作用。

發酵溫度對乙醇發酵有顯著影響，因為糖化酶的最適溫度50～60℃遠高于釀酒酵母最佳增殖溫度29～32℃，因此在莖渣的糖化和酵母發酵之間需要一個最佳溫度能最大限度滿足糖化和乙醇發酵的需要。工藝優化所得最佳溫度為36.58℃，比普通發酵的溫度高。糖化酶添加量控制著甜高粱莖渣纖維素及半纖維素的酶解過程中葡萄糖及木糖的生成，從而影響乙醇的產量，糖化酶添加量過少會導致乙醇發酵不徹底，添加量過大會造成成本增加[27]。莖渣比也是顯著影響乙醇發酵的因素，渣汁比過低就不能充分利用莖稈里的纖維素和半纖維素，渣汁比過高，糖化過程產生抑制物過多，同時也不利于酶和渣的接觸而降低酶解的效率。SSF發酵時間過長會增加成本，本研究比最新甜高粱莖渣SSF縮短108 h[28]。

利用響應面優化設計優化了重組釀酒酵母對甜高粱莖稈渣汁混合同步糖化發酵的發酵條件，得到了一個同步糖化發酵條件的優化組合，應用該同步糖化發酵的優化組合條件對渣汁混合物上罐發酵，乙醇產量達到88.98%，接近最新研究報道的89.4%[27]，乙醇質量濃度達到31.79 g/L，這比相同溫度條件下，單純以甜高粱莖汁為原料發酵所得乙醇質量濃度提高了5.45 g/L。

發酵終產物乙醇產量提高的原因歸因于甜高粱莖渣糖化提供了可發酵的葡萄糖以及木糖。莖渣之所以能夠與莖汁混合進行發酵，一個很重要的原因就是莖渣糖化過程在短時間內能達到大量葡萄糖及木糖等可發酵糖，這有利于釀酒酵母的乙醇發酵；而糖化酶添加則是將莖渣里的纖維素和半纖維素轉化為葡萄糖和木糖的保障，最優的發酵溫度能將莖渣的糖化和乙醇發酵協調起來。發酵溫度、糖化酶添加量及甜高粱莖稈渣汁比3個重要因素被證明有利于終產物乙醇的產量提高，三者的最優組合從而達到生產工藝簡化，乙醇產量提高。這為甜高粱等許多作物秸稈的燃料乙醇的生產提供參考，以期提高經濟效益。

4　結　論

1）PB試驗確定的影響甜高粱秸稈渣汁混合乙醇SSF 的3個顯著因素：發酵溫度、糖化酶和甜高粱秸稈渣汁比。

2）通過BB試驗建立了SSF的乙醇質量濃度與3個顯著因素的回歸模犁。

3）響應面二次回歸方程模型確定并驗證了甜高粱秸稈渣汁SSF法生產酒精的最佳工藝參數：溫度為36.58℃，酶添加量為23.5 FBU/35.25 CBU，甜高粱渣汁比為8.2%，接種量為0.2%原料，發酵溫度為36℃，尿嘧啶質量分數0.1%，(NH4)2SO4質量分數0.5%，pH值5，發酵時問60 h。該條件下驗證，乙醇產量達到88.98%，醇質量濃度為31.78 g/L，與模型乙醇產量無顯著性差異。

[參考文獻]

[1] Gullison R E, Frumhoff P C, Canadell J G, et al., Tropical forests and climate policy[J]. Environment, 2007, 316(5827): 985－986.

[2] Liu H, Ren L, Spiertz H, et al. An economic analysis of sweet sorghum cultivation for ethanol production in North China[J]. GCB Bioenergy, 2014.

[3] 黎大爵. 調整產業結構，發展甜高粱乙醇燃料產業[J]. 農業工程學報，2003(19)：168－171.

[4] 閆鴻雁，付立中，胡國宏，等. 國內外甜高粱研究現狀及應用前景分析[J]. 吉林農業科學，2006，31(5)：63－65.

[5] Gnansounou E, Dauriat A, Wyman C E. Refining sweet sorghum to ethanol and sugar:economic trade-offs in the context of North China[J]. Bioresource Technology, 2005, 96(9): 985－1002.

[6] Andrea Monti, Gianpietro Venturi. Comparison of the energy performance of fibre sorghum,sweet sorghum and wheat monocultures in north Italy[J]. European Journal of Agronomy, 2002, 19(1): 35－43.

[7] Chun L H, Overend R P. Biomass and renewable fuels[J]. Fuel Bioprocess Technology, 2001, 71(1): 187－195.

[8] Cao W X, Sun C, Liu R H, et al. Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse[J]. Bioresour Technol, 2012, 111: 215－221.

[9] Matsakas L, Christakopoulos P. Optimization of ethanol production from high drymatter liquefied dry sweet sorghum stalks[J]. Biomass Bioenerg, 2013, 51: 91－98.

[10] Ratnavathi C V, Suresh K, Kumar B S V, et al. Study on genotypic variation for ethanol production from sweet sorghum juice[J]. Biomass Bioenerg, 2010, 34: 947－952.

[11] Wang E Q, Li S Z, Tao L, et al. Modeling of rotating drum bioreactor for anaerobic solid-state fermentation[J]. Appl Energy, 2010, 87: 2839－2845.

[12] Yu Z L, Zhang X, Tan T W. Ethanol production by solid state fermentation of sweet sorghum using thermotolerant yeast strain[J]. Fuel Process Technol, 2008, 89: 1056－1059.

[13] Yu J, Zhong J, Zhang X, Tan T. Ethanol production from H2SO3-steam pretreated fresh sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160: 401－409.

[14] 黎大爵，廖馥蓀. 1992. 甜高粱及其利用[M]. 北京：科學出版社.

[15] Gnansounou E, Dauriat A, Wyman C. Refining sweet sorghum to ethanol and sugar: economic trade-offs in the context of North China[J]. Bioresource Technology, 2005, 96(9): 985－1002.

[16] Olofsson K, Bertilsson M, Lidén G. A short review on SSF-an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks[J]. Biotechnol Biofuels, 2008, 1(7): 1－14.

[17] 張寧，蔣劍春，程荷芳，等. 木質纖維生物質同步糖化發酵(SSF)生產乙醇的研究進展[J]. 化工進展，2010，29(2)：238－242.

[18] Chen H, Xu J, Li Z. Temperature cycling to improve the ethanol production with solid state simultaneous saccharification and fermentation[J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2007, 43(1): 57－60.

[19] Lin Y, Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 69(6): 627－642.

[20] Prasad B, Mishra I M. On the kinetic and effectiveness of immobilized whole- cell batch cultures[J]. Bioresource Technology, 1995, 53(3): 269－275.

[21] 金慧，劉榮厚，沈飛，等. 甜高粱汁固定化酵母乙醇發酵工藝優化的試驗研究[J]. 農業工程學報，2008，24(4)：194－198. Jin Hui, Liu Rongle, Shen Fei, et al. Optimization of conditions for the ethanol production by immobilized saccharomyces cerevisiae from sweet sorghum stem juice[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2008, 24(4): 194－198.(in Chinese with English abstract)

[22] 周紅麗，譚興和，劉志偉，等. 南瓜籽粕酶法制備血管緊張素轉化酶抑制肽工藝優化[J]. 農業工程學報，2015，31(Supp 1)：373－378. Zhou Hongli, Tan Xinghe, Liu Zhiwei, et al. Process optimization for preparation of ACE inhibition peptide from pumpkin seed meal by using enzymatic hydrolysis method[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(Supp.1): 373－378. (in Chinese with English abstract)

[23] 王賢，張苗，木泰華. 甘薯渣同步糖化發酵生產酒精的工藝優化[J]. 農業工程學報，2012，28(14)：256－261. Wang Xian, Zhang Miao, Mu Taihua. Process optimization Oil alcohol production using sweet potato residue by simultaneous saccharifieation and fermentation method[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(14): 256 －261. (in Chinese with English abstract)

[24] Phutela U G, Kaur J. Process optimization for ethanol production from sweet sorghum juice using saccharomyces cerevisiae strain NRRL Y-2034 by response surface methodology[J]. Sugar Tech, 2014, 16(4): 411－421.

[25] Luo Z, Wang L, Shahbazi A. Optimization of ethanol production from sweet sorghum (Sorghum bicolor) juice using response surface methodology[J]. Biomass and Bioenergy, 2014, 67: 53－59.

[26] Yesuf J N, Liang Y. Optimization of sugar release from sweet sorghum bagasse following solvation of cellulose and enzymatic hydrolysis using response surface methodology[J]. Biotechnology Progress, 2014, 30(2): 367－375.

[27] 劉振，王金鵬，張立峰，等.木薯干原料同步糖化發酵生產乙醇[J]. 過程工程學報，2005，5(3)：353－357.

[28] Wang L, Luo Z, Shahbazi A. Optimization of simultaneous saccharification and fermentation for the production of ethanol from sweet sorghum (Sorghum bicolor) bagasse using response surface methodology[J]. Industrial Crops and Products, 2013, 42: 280－291.

·土地整理工程·

Optimization of ethanol production from bagasse and juice of sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation

Chen Chaoru1,2, Wang Zhi2, Ma Qiang1, Zhang Lina2, Xi Yajun1※, Dun Baoqing2, Li Guiying2, Lu Ming2, Du Fengguang3
(1. College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement of Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3.State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology, Nanyang 473000, China)

Abstract:Ethanol production from energy crops which are renewable resources has gotten more and more attentions because of the energy crisis and environmental pollution. Sweet sorghum is considered as the most promising energy crop for the production of ethanol. Sweet sorghum stem is usually used to ferment ethanol, one of which is the liquid-state fermentation with the juice of sorghum stem. But a lot of bagasse of sorghum stem is discarded as wastes. The bagasse can be used as the supplemental materials of the fermentation of the juice. So it is absolutely necessary to study on the optimization of ethanol production with the bagasse and juice of the sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation (SSF). The response surface is an effective method to optimize the operating parameters of the SSF for the maximum ethanol yield. In this study, the Plackett-burman design was adopted to select the significant factors from 8 variables which influenced the ethanol yield and its concentration. The results indicated the ethanol yield and concentration were mainly influenced by the fermentation temperature, the amount of cellulase and the ratio of sorghum stem bagasse to its juice (P<0.05). And the other 5 variables which were not significant were remained to be the center level: the pH value was 5.5, the inoculation ratio was 0.2%, the amount of (NH4)2SO4was 5 g/L, the fermentation time was 60 h, and the amount of uracil was 1 g/L. Based on the results of the selection, the steepest ascent experiment was conducted to determine the center point and the step size. The center point of the fermentation temperature was 37℃ and its step size was 3℃. The center point of the amount of cellulase was 20 FBU/30 CBU and its step size was 5 FBU/CBU. The center point of the ratio of bagasse to its juice was 7% and its step size was 1.5%. Then we adopted the Box-Behnken design and response surface analysis method to optimize the levels of these 3 significant factors, and the regression and the optimal levels of these significant factors were as follows: the regression model was very significant (P<0.0001, R2=0.9987, Adj. R2=0.9971 and CV=0.0099), which indicated that the model was reliable, and therefore, the regression model could be used for the theoretical prediction of the SSF for juice and bagasse of sweet sorghum stem; the fermentation temperature was 36.58℃, the amount of cellulase was 23.5 FBU/35.25 CBU, the ratio of bagasse to juice of sorghum stem was 8.2%, the maximum theoretical yield of ethanol predicted was 89.2%, and the ethanol concentration was 31.829 g/L. The interactive effects were analyzed by response surface analysis. The interactive effect of the fermentation temperature and the amount of cellulase was very significant (P<0.0001); the interactive effect of the amount of cellulase and the ratio of bagasse to juice was very significant (P<0.001); the interactive effect of the fermentation temperature and the ratio of bagasse to juice was not significant (P=0.2946). Under the optimal conditions, the model was proved to be valid by the verification test with 3 repeated tests, and the ethanol yield was 88.98% which was very close to the maximum yield (89.2%). The ethanol concentration was 31.78 g/L, which was very close to theoretical prediction value (31.829 g/L). The results of this optimal technology will provide a reference for the ethanol production technology by simultaneous saccharification and fermentation method for sweet sorghum stem.

Keywords:fermentation; ethanol; optimization; sweet sorghum stem juice; sweet sorghum stem bagasse; simultaneous saccharification and fermentation; response surface methodology

通信作者：※奚亞軍，男，陜西白水人，教授，博士生導師，主要從事小麥和生物能源植物柳枝稷的基因工程研究。楊凌西北農林科技大學農學院，712100。Email：xiyajun11@126.com

作者簡介：陳朝儒，男，陜西城固人，西北農林科技大學，博士生，主要從事作物育種及生物質能源研究。楊凌西北農林科技大學農學院，712100。Email：chenchaoru2009@163.com

基金項目：國家自然科學基金面上項目--生物能源作物柳枝稷人工穗芽形成機制研究（31171607），農業部公益性行業（農業）科研專項（201503135），中國農業科學院科技創新工程。

收稿日期：2015-07-13

修訂日期：2015-12-30

中圖分類號：S216.2；Q77

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6819(2016)-03-0253-06

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037