冬季低溫條件下香石竹小孢子敗育的細胞學研究

周旭紅,蔣亞蓮,李姝影,蘇　艷,莫錫君,桂　敏

(云南省農業科學院花卉研究所,云南省花卉育種重點實驗室,國家觀賞園藝工程技術研究中心,昆明 650205)

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冬季低溫條件下香石竹小孢子敗育的細胞學研究

周旭紅,蔣亞蓮,李姝影,蘇艷,莫錫君,桂敏*

(云南省農業科學院花卉研究所,云南省花卉育種重點實驗室,國家觀賞園藝工程技術研究中心,昆明 650205)

摘要:利用壓片法及石蠟切片法觀察冬季低溫下香石竹小孢子發育過程,以明確低溫導致香石竹小孢子敗育的因素,為雜交育種奠定基礎。結果表明:(1)冬季低溫下香石竹只有部分小孢子發育正常,經過小孢子母細胞、減數分裂和四分體等時期,最后發育成花粉。(2)石蠟切片法觀察到冬季低溫下香石竹1.5～1.6 cm長花蕾中有61 %的花粉母細胞發生敗育,1.7～1.8 cm長花蕾中有71%的花粉母細胞發生敗育。(3)部分已經進入四分體時期的小孢子胼胝質未能及時溶解,妨礙了小孢子釋放而導致敗育。研究認為,花粉母細胞和四分體的發育異常是冬季低溫下香石竹小孢子敗育的主要原因。

關鍵詞:低溫;香石竹;花粉;敗育

香石竹(DianthuscaryophyllusL.)是云南及全球主栽的鮮切花之一。目前,絕大多數香石竹品種依賴國外進口,缺乏擁有自主知識產權的新品種是制約中國花卉產業發展的重要因素,培育占有一定市場份額的新品種是亟待解決的主要問題。

香石竹雜交一般在每年的4～10月份進行(北方的雜交時間更短),到了冬季氣溫下降不適合進行雜交育種。當氣溫在10～17 ℃時,絕大多數香石竹無雄蕊或雄蕊發育不全,花粉敗育[1]。傅小鵬等[2]研究石竹雄性不育系小孢子敗育的原因,發現不育系敗育現象在造孢細胞增殖期、小孢子母細胞減數分裂期以及四分體至單核期都有發生,不育花粉外形空癟,不規則,無生活力。絨氈層的異常發育是導致小孢子敗育的主要原因。而香石竹冬季低溫花粉敗育的原因很少有人報道,本研究采用壓片法及石蠟切片觀察冬季香石竹小孢子發育過程,探討小孢子敗育的原因,可為闡明其不育機理提供細胞學資料,為合理利用種質資源、利用雜交優勢進行新品種選育提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料

供試材料為香石竹品種‘Promesa’,取自云南省農業科學院花卉研究所寶峰基地。

1.2方法

1.2.1花粉活力測定采用醋酸洋紅染色測定法。分別于2013年3月、6月、9月和12月取3朵香石竹花的花藥放入干燥皿中過夜干燥,將花藥置于載玻片上,擠壓后去除雜質,加2～3滴1%醋酸洋紅溶液,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察。統計花粉的活力及花粉直徑,SPSS 18.0軟件計算均值和標準差。

花粉生活力=(著色花粉數/觀察花粉數)×100%

1.2.2壓片法觀察小孢子發育2013年12月選取生長發育正常的植株,取香石竹不同長度的花蕾,重復3～4朵花,長度分別為0.9～1.0、1.1～1.2、1.3～1.4、1.5～1.6、1.7～1.8、1.9～2.0、2.1～2.2和2.3～2.6 cm的花蕾,用FPA固定液(福爾馬林∶丙酸∶70%酒精=1∶1∶18)固定,用清水漂洗3次,60 ℃ 1 mol/L HCl酸解10 min,清水漂洗3次,卡寶品紅染色30 min后壓片,在光學顯微鏡下觀察花粉母細胞減數分裂過程。統計不同長度的花蕾四分體時期一分體、二分體、三分體和四分體的個數,采用SPSS 18.0軟件作圖。

1.2.3石蠟切片法觀察小孢子發育2013年12月用FPA固定液固定不同長度的花蕾,重復3～4朵花。將固定的花蕾,用清水洗凈2次后,滴上蘇木素染液,染色12 h。將染液洗凈,用70%乙醇洗2次,每次10 min,用70%乙醇浸泡材料12 h。再經過逐級脫水,透明,浸蠟及包埋等步驟,最后切片,切片厚度8～12 μm,Nikon E800顯微鏡觀察和拍攝。統計不同長度的花蕾,小孢子處于不同發育時期的細胞的百分率,采用SPSS 18.0軟件作圖。

2結果與分析

2.1不同季節花粉的活力

由表1可以看出,不同季節香石竹‘Promesa’的花粉活力差異顯著,其中在3月和12月的花粉活力(22.23%和21.60%)顯著低于6月和9月(70.82%和71.41%),而且6月和9月為高溫季節,溫度分別為22.84 ℃和21.17 ℃;3月和12月屬低溫季節,溫度分別為14.12 ℃和14.48 ℃。說明溫度可能是影響香石竹花粉活力的因素之一。

2.2壓片法觀察冬季香石竹小孢子發育過程

冬季香石竹‘Promesa’花蕾長0.9～1.2 cm時,小孢子發育處于花粉母細胞時期,小孢子母細胞的細胞質濃厚、液泡小、細胞核大(圖版Ⅰ,A、B);隨之小孢子母細胞之間形成胼胝質壁,逐漸增大,進入減數分裂時期(花蕾長1.3～1.4 cm;圖版Ⅰ,C);當花蕾1.5～1.6 cm時,小孢子減數分裂形成的四分體由胼胝質包圍(圖版Ⅰ,D),并出現異常的二分體(圖版Ⅰ,E)和三分體(圖版Ⅰ,F),有部分仍處于減數分裂階段(圖版Ⅰ,G);1.7～1.8 cm長花蕾,部分小孢子處于四分體時期(圖版Ⅰ,H);花蕾發育到1.9～2.0 cm時,少數發育為單核期小孢子,但仍有部分小孢子處于四分體時期,(圖版Ⅰ,I～J);當花蕾長2.1～2.6 cm時,小孢子發育為成熟的花粉(圖版Ⅰ,K～L)。

表1　不同季節香石竹‘Promesa’花粉活力

注:同列不同字母表示差異顯著(P≤0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant differences(P≤0.05).

由圖1可以看出,3月(春季),香石竹‘Promesa’四分體時期出現在1.3～1.8 cm長的花蕾中,花蕾長1.3～1.6 cm時,以四分體居多,其它分體只占少量的比例;花蕾長1.7～1.8 cm時,四分體和二分體所占比例較大。到6月(夏季),香石竹‘Promesa’四分體時期出現在1.3～1.6 cm長的花蕾中,且主要是四分體細胞。9月(秋季)1.5～1.6 cm長的花蕾為小孢子四分體時期,絕大部分是四分體細胞。到了12月(冬季),1.5～2.0 cm長的花蕾觀察到四分體,1.5～1.6 cm長的花蕾絕大部分是四分體細胞,1.7～2.0 cm長的花蕾四分體和其它分體都占有一定的比例。由此可見,高溫季節(6月和9月),花蕾長1.7 cm時,四分體時期已結束;而低溫季節(3月和12月),在花蕾長1.7～1.8 cm或1.7～2.0 cm時還有部分花粉母細胞處于四分體時期,可能的原因是低溫引起四分體時期胼胝質不能及時解體,小孢子未能釋放出來。

A.3月;B.6月;C.9月;D.12月

2.3石蠟切片法觀察冬季香石竹小孢子發育過程

冬季香石竹‘Promesa’花蕾長0.9～1.2 cm時處于花粉母細胞時期,細胞核大且細胞質濃,此時花藥壁由外向內分化為表皮、藥室內壁、中層和絨氈層,絨氈層細胞排列整齊具一至多核,細胞質濃厚(圖版Ⅱ,A、B);1.3～1.4 cm長花蕾94%的小孢子處于花粉母細胞(圖版Ⅱ,C)和6%的小孢子進行減數分裂(圖版Ⅱ,D;圖2);1.5～1.6 cm長花蕾中,22%小孢子處于花粉母細胞時期(圖版Ⅱ,E),61%花粉母細胞發生敗育(圖版Ⅱ,F),13%小孢子仍處于減數分裂時期(圖版Ⅱ,G),只有4%小孢子母細胞完成正常的減數分裂,分裂完成時在 4個核間產生細胞壁,并分隔成由胼胝質所包圍的 4 個細胞,形成正四面體形的小孢子四分體,4個小孢子處于共同的胼胝質中(圖版Ⅱ,H;圖2);1.7～1.8 cm長花蕾中71%花粉母細胞發生敗育(圖版Ⅱ,I),29%處于四分體時期(圖版Ⅱ,J;圖2);62%的1.9～2.0 cm長花蕾形成花粉,隨著胼胝質壁溶解,四分體分開形成單核小孢子,并在原小孢子初生壁的基礎上形成真正的外壁。起初形成的單核小孢子細胞質濃,核大并居中,它們聚集在藥室的中央,絨氈層開始降解(圖版Ⅱ,K),另有38%小孢子還處于四分體階段,胼胝質壁并未溶解(圖版Ⅱ,L);2.1～2.6 cm長,小孢子細胞質中小孢子壁的增厚,殘余的絨氈層細胞則逐漸脫離花藥壁,作為營養被發育中的小孢子所吸收,花粉粒逐漸發育成熟(圖版Ⅱ,M～O)。由圖2可見,0.9～1.4 cm長花蕾中,絕大多數減數分裂細胞處于花粉母細胞時期,1.5～1.8 cm長花蕾中,花粉母細胞時期開始敗育,少數花粉母細胞進入四分體時期,1.9～2.6 cm長花蕾中,四分體開始解體,形成單核小孢子,并逐漸發育成熟。冬季低溫可能影響減數分裂時期花粉母細胞的發育。

圖2　冬季不同大小香石竹花蕾中不同時期

3討論

雄性不育材料類型不同,花粉敗育的時期和原因也不盡相同。辣椒不育系8A敗育時期發生在四分體時期,進入四分體時期,絨氈層細胞徑向異常膨大高度液泡化并入侵藥室,擠壓形成不規則的四分體,皺縮凹陷,有的小孢子四分體還出現粘連現象,不能產生正常小孢子[3]。甘藍型油菜不育系105A的花藥敗育是由于一部分花藥發育受阻于造孢細胞時期,另一部分花藥發育受阻于單核晚期[4]。張文超等[5]發現,胼胝質的異常合成與分布是毛白楊花粉敗育的原因之一。石竹花粉敗育現象在造孢細胞增殖至小孢子母細胞進行減數分裂以及釋放小孢子形成的各個階段都有發生[2]。

本研究發現冬季香石竹品種‘Promesa’花粉活力低,石蠟切片觀察到1.5～1.6 cm長花蕾中,61%花粉母細胞發生敗育,1.7～1.8 cm長花蕾中有71%花粉母細胞發生敗育,小孢子花粉母細胞的敗育集中在1.5～1.8 cm長花蕾中,花粉母細胞發生敗育是冬季香石竹品種‘Promesa’花粉敗育的主要原因。此外,3月和12月四分體時期分別出現在長為1.3～1.8 cm和1.5～2.0 cm的花蕾,而6月和9月四分體時期分別出現在長為1.3～1.6 cm和1.5～1.6 cm的花蕾中。由此可見,高溫季節四分體時期時間較短,而低溫季節四分體時期時間較長,四分體時期胼胝質未能及時解體,從而導致小孢子不能釋放出來。綜上,低溫可能導致花粉母細胞發生敗育以及胼胝質不能及時溶解,進而致使小孢子的敗育,這還需更進一步證實。

參考文獻:

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Explanation of plates:

Piate ⅠDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by squash observation in winter

Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm bud;Fig.C.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm cm bud;Fig.D.Tetrad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.E.Dyad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.F.Triad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm cm bud;Fig.H.Tetrads in 1.7-1.8 cm bud;Fig.I.Tetrad and uninuclear microspore in 1.9-2.0 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.9-2.0 cm bud;Fig.K.Mature pollen in 2.1-2.2 cm bud;Fig.L.Mature pollen in 2.3-2.6 cm bud.

Piate ⅡDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by section observation in winter

Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm of bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm of bud;Fig.C.Microspore mother cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.D.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.E.Microspore mother cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.F.Abortion in microspore mother cell of 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.H.Tetrad in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.I.Abortion in microspore mother cell of 1.7-1.8 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.7-1.8 cm of bud;Fig.K.Microspore in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.L.Tetrad in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.M.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.N.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.O.Mature pollen in 2.3-2.6 cm of bud.

圖版 Ⅰ冬季香石竹不同長度花蕾小孢子的發育特征(壓片法)

A.0.9～1.0 cm長花蕾花粉母細胞時期;B.1.1～1.2 cm長花蕾花粉母細胞時期;C.1.3～1.4 cm長花蕾減數分裂時期;D.1.5～1.6 cm長花蕾四分體細胞;E.1.5～1.6 cm長花蕾二分體細胞;F.1.5～1.6 cm長花蕾三分體細胞;G.1.5～1.6 cm長花蕾減數分裂時期;H.1.7～1.8 cm長花蕾四分體細胞;I.1.9～2.0 cm長花蕾四分體時期和單核期細胞;J.1.9～2.0 cm長花蕾四分體時期;K.2.1～2.2 cm長花蕾成熟的花粉粒;L.2.3～2.6 cm長花蕾成熟的花粉粒。

圖版 Ⅱ冬季香石竹不同長度花蕾小孢子的發育特征(石蠟切片法)

A.0.9～1.0 cm長花蕾花粉母細胞時期;B.1.1～1.2 cm長花蕾花粉母細胞時期;C.1.3～1.4 cm長花蕾花粉母細胞;D.1.3～1.4 cm長花蕾減數分裂時期;E.1.5～1.6 cm長花蕾花粉母細胞;F.1.5～1.6 cm長花蕾花粉母細胞發生敗育;G.1.5～1.6 cm長花蕾減數分裂細胞;H.1.5～1.6 cm長花蕾四分體時期;I.1.7～1.8 cm長花蕾花粉母細胞發生敗育;J.1.7～1.8 cm長花蕾四分體細胞;K.1.9～2.0 cm長花蕾形成花粉;L.1.9～2.0 cm長花蕾四分體細胞;M.2.1～2.2 cm長花蕾成熟的花粉粒;N.2.1～2.2 cm長花蕾成熟的花粉粒;O.2.3～2.6 cm長花蕾成熟的花粉粒。

(編輯:潘新社)

Cytological Research on Microspore Abortion ofDianthuscaryophyllusunder Low Temperature Environment in Winter

ZHOU Xuhong,JIANG Yalian,LI Shuying,SU Yan,MO Xijun,GUI Min*

(Flower Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Science,Key Laboratory of Flower Breeding of Yunnan Province,National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture,Kunming 650205,China)

Abstract:The mechanism of pollen abortion of Dianthus caryophyllus was studied under low temperature environment in winter for further research hybrid breeding.Microsporogenesis process of male sterile was histologically examined using squash technique and paraffin embedded method.The results demonstrated:(1)only few mature pollen grains in winter was followed through the initiation of the microsporocyte formation,meiosis and the tetrad developmental period,finally formed pollen.(2)61% pollen mother cells aborted in 1.5-1.6 cm of buds and 71% pollen mother cells aborted in 1.7-1.8 cm of buds.(3)Furthermore,the portion of callose of tetrad could not dissolve resulting in microspores unreleased into the chamber.In brief,abnormal pollen mother cell and tetrad are the main cause of microspore in low temperature of winter.

Key words:low temperature;carnation;pollen;abortion

中圖分類號:Q944.58

文獻標志碼:A

作者簡介:周旭紅(1978-),女,碩士,副研究員,主要從事花卉遺傳育種研究工作。E-mail:zhouxuhong7801@126.com*通信作者:桂敏,研究員,主要從事花卉遺傳育種研究工作。 E-mail:gming-114@163.com

基金項目:國家自然科學基金(31460530,31260491);國家觀賞園藝工程技術研究中心(2012FU125X10);云南省應用基礎研究計劃(2014FA044);院創新團隊(2014CZYY019);云南省中青年學術和技術帶頭人培養項目

收稿日期:2015-08-19;修改稿收到日期:2015-11-01

文章編號:1000-4025(2016)01-0037-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0037