急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達變化

屈丹，姜雅秋

(1中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽 110001；2本溪市中心醫院)

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急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達變化

屈丹1,2，姜雅秋1

(1中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽 110001；2本溪市中心醫院)

摘要：目的觀察急性低血糖大鼠血清胰高血糖素樣肽1(GLP-1)蛋白及下丘腦組織GLP-1受體(GLP-1R)蛋白、mRNA表達變化。方法 Wistar雄性大鼠21只，其中14只大鼠腹腔注射短效胰島素誘導急性低血糖，血糖在2.00～2.64 mmol/L者計為A組(7只)，血糖<2.0 mmol/L者計為B組(7只)；另7只大鼠(C組)不采用任何干預措施，血糖維持在正常水平。采用ELISA法檢測各組血清GLP-1，Western blotting法和實時熒光定量PCR法分別檢測下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA。結果與B組比較，A組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達降低；與C組比較，A組血清GLP-1、下丘腦組織GLP-1R mRNA及B組血清GLP-1表達降低，A組下丘腦組織GLP-1R蛋白及B組下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達升高；P均<0.05。結論 急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白表達降低，下丘腦組織GLP-1R蛋白表達升高，輕度低血糖時GLP-1R mRNA相對表達量下降、重度時升高。

關鍵詞：低血糖；胰高血糖素樣肽1；胰高血糖素樣肽1受體；動物實驗

機體在應激時會為生存做出必須的生物調整來維持體內平衡[1]，包括刺激腦中通路引起下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸和交感神經系統(SNS)軸的激活，從而導致一系列神經內分泌反應。室旁核的促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)神經元是啟動HPA軸反應的重要構成。研究[2]發現，CRH神經元的分泌活動直接接受胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的調控，中樞GLP-1能調節HPA軸的應激反應[3～5]。急性低血糖是一種急性應激狀態，在低血糖發生時下丘腦的“糖感受器”將信息迅速傳遞到相關神經元，引起下丘腦CRH細胞興奮，CRH神經元的分泌活動直接接受GLP-1的調控，GLP-1受體(GLP-1R)同時在下丘腦表達。2013年9月～2015年3月，我們觀察了急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達變化，旨在探討急性低血糖應激時中樞神經系統GLP-1R是否參與應激調節。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑SPF級Wistar雄性大鼠21只，3～8周齡，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物中心。大鼠GLP-1 ELISA試劑盒購自美國R&D公司(貨號CK-E 30402R)，TRIzol、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、GLP-1R及β-actin引物購自大連寶生物公司，GLP-1R一抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2實驗動物分組及短效胰島素干預21只大鼠分為A、B、C組各7只，A、B組參照文獻[6]方法腹腔注射短效胰島素(生物合成人胰島素，50 U/kg)。以微型血糖儀測量血糖，并記錄所有大鼠腹腔注射胰島素后每隔30 min的血糖值，直至達到目標血糖。A組大鼠血糖2.00～2.64 mmol/L，大鼠興奮，身體發抖，四處覓食；B組大鼠血糖<2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚，甚至全身抽搐。C組大鼠不采用任何干預措施，血糖維持在正常水平[7]。大鼠稱體質量，10%水合氯醛腹腔麻醉，上腹正中切口，游離肋骨，心臟采血，3 000 r/min離心 10 min，分離血清，存入Eppendorf管中，-80 ℃冰箱中保存。大鼠經心臟采血后斷頭，3 min內取腦，分離腦組織后迅速置于-40 ℃干冰異戊烷中，30 s快速冷凍腦組織，后于-80 ℃冰箱凍存。

1.3大鼠血清GLP-1蛋白檢測采用ELISA法檢測，操作按照試劑盒說明書進行。

1.4大鼠下丘腦組織GLP-1R蛋白檢測采用Western blotting法。組織裂解液裂解下丘腦組織，12 000 r/min離心5 min，取上清，測定總蛋白。已溶解于加樣緩沖液的總蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V電泳轉移至硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉液封閉2 h，用1∶100稀釋GLP-1R抗體(兔抗鼠多克隆抗體)進行Western 蛋白印跡雜交，40 ℃孵育過夜。1∶400稀釋的二抗孵育2 h，采用DAB顯色試劑盒顯影并檢測，獲得蛋白相對表達定量。GLP-1R蛋白表達以GLP-1R/β-actin灰度值比率來計算。

1.5大鼠下丘腦組織GLP-1R mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。取下丘腦組織50～100 mg，提取總RNA，并進行逆轉錄反應得到cDNA，再進行實時熒光定量PCR反應。GLP-1R：5′-CAT CGC TTC AGC CAT CCT TG-3′，5′-CAG CCG TGC TAT ACA TCC ACT TG-3′，162 bp；GAPDH: 5′-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3′，5′-CCA TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG-3′，123 bp；反應體系25 μL，逆轉錄反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR反應條件：95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次；PCR反應結束后，分析DNA擴增曲線，使用專用數據處理軟件獲取數據，以2-ΔΔCT代表目的基因mRNA的相對表達量。

2結果

各組大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達比較見表1。

表1　各組大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3討論

GLP-1屬于胃腸激素，主要由末端空腸、回腸、結腸的L細胞分泌，是胰高血糖素原(PPG)基因翻譯表達的產物。葡萄糖、脂肪等營養物質均能直接刺激GLP-1的釋放。GLP-1與其受體特異性結合后，發揮抑制胰高糖素分泌、促進胰島細胞增殖、抑制胃排空、抑制胃酸分泌等多種生物學作用[8～11]。也有研究[12]表明，GLP-1在調節攝食和體質量方面發揮重要作用，如抑制水的攝入、維持血糖水平、調節心率和血壓以及調節HPA軸的應激反應[3～5]。盡管血液循環中GLP-1不易通過血腦屏障，但這些影響可能通過中樞神經系統的GLP-1神經元來調節。

GLP-1R分布廣泛，除胰腺和胃腸道外，還分布于肺、腎臟和心臟等全身多個組織和器官，在周圍神經系統與中樞神經系統表達豐富[13,14]。Northern雜交試驗表明，GLP-1R在胰島、肺和心臟中的表達量較其他組織高。從胰島、心臟和大腦克隆得到的cDNA片段編譯的氨基酸序列相同，且與GLP-1的親和力相同，表明GLP-1R在中樞神經系統和心血管系統均具有一定的生物學功能。另外研究[15]發現，GLP-1R的表達在不同部位受不同因素的影響。

急性應激導致中樞GLP-1、PPG mRNA明顯下調。慢性應激也導致孤束核PPG mRNA和室旁核GLP-1免疫反應性下調。PPG mRNA下調可以被糖皮質激素長短反饋調節，這也許是限制應激導致的HPA軸工作過度的一種適應機制[16]。GLP-1減少與應激中止后1～2 h生理不應期相一致，阻止了HPA軸過度激活和潛在的有害后果，同樣長期下調可能限制GLP-1神經元重復激活的影響，可能也是應激的一個重要適應機制。本研究顯示，A、B組血清GLP-1蛋白表達低于C組，可見急性低血糖應激與其他應激反應相同，此時血清GLP-1也是減少。A、B組下丘腦組織GLP-1R蛋白表達升高，分析其原因考慮為GLP-1需與GLP-1R特異性結合才能發揮其生物學作用，大鼠下丘腦組織GLP-1R蛋白表達雖然升高，但急性應激時GLP-1生物利用度減少導致GLP-1激動減少，這種變化也有助于應激時HPA軸恢復。本研究還顯示，與C組比較，A組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達降低，B組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達升高，這種變化也與應激中止后1~2 h生理不應期相一致，阻止了HPA軸過度激活和潛在的有害后果。

參考文獻：

[1] Mcewen BS. Physiology and neurobiology of stress and adaptation: central role of the brain[J]. Physiological Reviews, 2007,87(3):873-904.

[2] Ghosal S, Myers B, Herman JP. Role of central glucagon-like peptide-1 in stress regulation[J]. Physiol Behav, 2013,122(2):201-207.

[3] Hayes MR, Bradley L, Grill HJ. Endogenous hindbrain glucagon-like peptide-1 receptor activation contributes to the control of food intake by mediating gastric satiation signaling[J]. Endocrinology, 2009,150(6):2654-2659.

[4] Zhao S, Kanoski SE, Yan J, et al. Hindbrain leptin and glucagon-like-peptide-1 receptor signaling interact to suppress food intake in an additive manner[J]. Int J Obes, 2012,36(12):1522-1528.

[5] Sandoval D. CNS GLP-1 regulation of peripheral glucose homeostasis[J]. Physiology Behavior, 2008,94(5):670-674.

[6] 高俊杰,閻勝利,王婷婷.實驗性低血糖對糖尿病大鼠血清內皮素-1的影響[J].中國糖尿病雜志,2013,21(8):749-751.

[7] 王竹,楊月欣,向雪松,等.實驗大鼠血糖正常范圍的估算[J].衛生研究,2010,39(2):133-142.

[8] Steinert RE, Poller B, CastellI MC, et al. Orally administered glucagon-like peptide-1 affects glucose homeostasis following an oral glucose tolerance test inhealthy male subjects[J]. Clin Pharmacol Ther, 2009,86(6):644-650.

[9] Rotondo A, Amato A, Lentini L, et al. Glucagon-like peptide-1 relaxes gastric antrum through nitric oxide in mice[J]. Peptides, 2011,32(1):60-64.

[10] Holmes GM, Browning KN, Tong M, et al. Vagally mediated effects of glucagon-like peptide-1: in vitro and in vivo gastric actions[J]. J Physiol, 2009,587(19):4749-4759.

[11] 呂豐香,魏良洲,田字彬,等.迷走神經復合體注射GLP-1受體對糖尿病大鼠下丘腦GLP-1受體表達及胃排空的影響[J].胃腸病學與肝病學雜志,2013,22(4):333-336.

[12] Barrera JG, Sandoval DA, D′Alessio DA, et al. GLP-1 and energy balance: an integrated model of short-term and long-term control[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011,7(9):507-516.

[13] Holst JJ. The physiology of glucagon-like peptide 1[J]. Physiol Rev, 2007,87(4):1409-1439.

[14] Willard FS, Sloop KW. Physiology and emerging biochemistry of the glucagon-like peptide-1 receptor[J]. Exp Diabetes Res, 2012,2012:470851.

[15] Knauf C, Cani PD, Perrin C, et al. Brain glucagon-like peptide-1 increases insulin secretion and muscle insulin resistance to favor hepatic glycogen storage[J]. J Clin Invest, 2005,115(12):3554-3563.

[16] Zhang R, Packard BA, Tauchi M, et al. Glucocorticoid regulation of preproglucagon transcription and RNA stability during stress[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009,106(14):5913-5918.

(收稿日期:2015-09-23)

中圖分類號：R363.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.010

通信作者：姜雅秋(E-mail： jiangyaqiu@yeah.net)

基金項目：遼寧省重大疾病動物實驗研究及臨床應用項目(2012225021)。