人軟骨糖蛋白39對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞增殖的影響及意義

安燕，龐春艷，閆慧明

(1包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古包頭014030；2包頭醫學院第一附屬醫院)

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人軟骨糖蛋白39對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞增殖的影響及意義

安燕1，龐春艷2，閆慧明1

(1包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古包頭014030；2包頭醫學院第一附屬醫院)

摘要：目的觀察人軟骨糖蛋白39(HCgp-39)對類風濕關節炎(RA)患者外周血單個核細胞(PBMC)增殖的影響，并探討其意義。方法針對HCgp-39 cDNA的第183～203 bp和第361～381 bp分別設計并合成載體siRNA1和siRNA2。選取初診RA患者40例，取全血3 mL，分離并培養PBMC。將培養的PBMC隨機分為四組， HCgp-39-siRNA1組加入載體siRNA1，HCgp-39-siRNA2組加入載體siRNA2，對照組不加入載體，空載體組加入質粒載體pSUPER.basi;培養24 h，采用RT-PCR法檢測各組HCgp-39 mRNA表達，采用MTT法檢測細胞增殖抑制率。結果對照組、空載體組、HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組HCgp-39 mRNA灰度值分別為61.197±5.542、55.718±5.120、39.912±4.218、36.748±2.877，HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組低于對照組、空載體組(P均<0.05)；細胞增殖抑制率分別為0、9.27%、43.97%、43.74%，HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組高于對照組、空載體組(P均<0.05)。結論HCgp-39可促進RA患者PBMC增殖，通過RNAi技術特異性阻斷Hcgp-39表達可能為RA的治療提供新的手段。

關鍵詞：類風濕關節炎；軟骨糖蛋白-39；RNA干擾；外周血單個核細胞

類風濕關節炎(RA)是一種病因尚未明確的慢性全身性疾病，以慢性、對稱性、多關節滑膜炎和關節外病變為主要臨床表現。類風濕因子(RF)陽性是RA的診斷標準之一，但其在RA早期診斷及診斷準確性上存在較大的局限性[1]。人軟骨糖蛋白39(HCgp-39)是RA的一種新抗原[2,3]，其衍生肽與HLA-DR1、HLA-DR4基因具有很高的親和力，并能被RA外周血T淋巴細胞高度特異識別。研究證實，HLA-DR1和HLA-DR4基因通過抗原特異性免疫應答反應參與RA發病[4]。RA患者關節軟骨細胞、滑膜細胞和外周血單個核細胞(PBMC)均高度表達HCgp-39 mRNA[5]，而正常人幾乎沒有表達，且HCgp-39水平與RA活動性相關[4]，可能成為一種新的判斷RA病情的指標[6]。本研究通過RNA干擾(RNAi)技術[7]觀察HCGP-39對RA患者PBMC增殖的影響，并探討其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年10月～2014年12月

在包頭醫學院第二附屬醫院風濕免疫科初診的RA患者40例，均符合1987年美國風濕病協會RA診斷標準；未接受任何抗RA治療。其中女29例、男11 例，年齡(41±10)歲，均無嚴重感染、肝病、腫瘤、腎病、糖尿病及其他風濕性疾病等。

1.2載體的構建針對HCgp-39 cDNA的第183～203 bp和第361～381 bp設計合成兩條雙鏈DNA，分別命名為dsDNA1、dsDNA2。雙酶切后的pSUPER.basic與dsDNA連接，將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，并進行陽性克隆[8]。構建后的載體經酶切、重組體測序鑒定，分別命名為siRNA1和siRNA2。上述操作均由包頭醫學院第一附屬醫院中心實驗室完成。

1.3PBMC分離及處理清晨空腹抽取患者肘正中靜脈血3 mL于肝素鋰抗凝管中，取肝素抗凝新鮮全血3 mL，加等體積生理鹽水稀釋，取3 mL淋巴細胞分離液加入離心管，將稀釋后血液沿管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上面，1 900 r/min離心10 min，液體共分三層，上層為血漿，中層為淋巴細胞分離液，下層為血細胞，上層和中層之間云霧狀的為單個核細胞層。將吸管直接插入單個核細胞層并吸取該層細胞，放入另一離心管中，加入10 mL生理鹽水稀釋分離的淋巴細胞，1 700 r/min離心10 min，棄上清。重復洗滌1次，1 500 r/min離心10 min，棄上清。吹打重懸細胞，加入含10% FBS的RPMI 1640培養基，置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待分離培養的PBMC細胞長滿培養瓶底面積50%～60%時制成單細胞懸液，接種于96孔培養板，密度為1×105個/mL，每孔200 μL。隨機分為四組， HCgp-39-siRNA1組加入載體siRNA1，HCgp-39-siRNA2組加入載體siRNA2，對照組不加入載體，空載體組加入質粒載體pSUPER.basi。各組培養4 h，每孔加入含FBS的RPMI 1640培養液，繼續培養。

1.4HCgp-39 mRNA表達檢測各組培養24 h后收集細胞，提取RNA。將所需離心管、PCR反應管和微量吸頭在0.1% DEPC溶液中浸泡24 h，烘干后高壓滅菌備用。RNA提取步驟參照試劑盒說明書。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。HCgp-39上游引物：5′-TAAGGATCCATGAACACCCAGATG-3′，下游引物：5′-GTGAAGCTTCTAAGGACTTGCATC -3′，擴增產物為360 bp。以GAPDH作為內參照，GAPDH上游引物：5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′，擴增產物230 bp。取5 μL擴增產物，在120 V、90 mA條件下進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統照相并用軟件進行灰度值分析。

1.5細胞增殖抑制率檢測各組培養24 h時采用倒置顯微鏡觀察細胞增殖情況，并分別加入MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)，繼續培養4 h，吸出培養液后，加入二甲基亞砜150 μL/孔，室溫下將平板在微孔板上震蕩10 min，使結晶物完全溶解，用酶標儀在492 nm波長處測定各孔光密度值(OD值；用空白孔調零)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

2結果

2.1各組HCgp-39 mRNA表達比較對照組、空載體組、HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組灰度值分別為61.197±5.542、55.718±5.120、39.912±4.218、36.748±2.877，HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組低于對照組、空載體組(P均<0.05)。

2.2各組細胞增殖情況比較培養24 h時倒置顯微鏡下觀察發現，與對照組和空載體組相比，HCgp-39-siRNA1組與HCgp-39-siRNA2組細胞形態不規則，漂浮細胞增多，出現大量凋亡細胞團。對照組、空載體組、HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組細胞增殖抑制率分別為0、9.27%、43.97%、43.74%，HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組高于對照組、空載體組(P均<0.05)。HCgp-39-siRNA1組與HCgp-39-siRNA2組比較無統計學差異(P>0.05)。

注：M為100 bp DNA marker；1為RA對照組；2為空載體組；3為HCgp-39-siRNA1組；4為HCgp-39-siRNA2組。

圖1各組HCgp-39 mRNA表達

3討論

HCgp-39是一種含383個氨基酸的蛋白質，來源于關節軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞，與細菌殼質酶蛋白質家族有結構上的同源性，但并不具備殼質酶活性。目前HCgp-39的確切生理作用尚不明確，但已有研究表明其可能與組織重建有關，并能反映關節軟骨降解破壞和滑膜炎癥程度[4]。近年來已有研究提示，HCgp-39是RA自身免疫過程中重要的自身抗原[9,10]。

Johansen等[5]檢測156例RA患者的血清HCgp-39，發現54%的活動期患者血清HCgp-39水平升高，經治療病情緩解的患者HCgp-39水平下降30%，緩解期患者病情再次活動時血清HCgp-39水平相應升高；RA患者如果疾病早期即出現HCgp-39高表達，提示其已出現關節損害的X線表現。在RA患者PBMC中也發現HCgp-39高表達，而正常人PBMC不表達此基因。研究發現，HCgp-39表達與RA活動性指標紅細胞沉降率(ESR)、IgM-RF有關[11,12]。但Syversen等[13]報道，RA患者血清HCgp-39水平與其放射學改變無明顯相關性；與上述報道不符，可能與所選病例及其病程、疾病分期和活動度不同有關。

目前尚沒有HCgp-39用于RA臨床應用的報道，但國內外學者已經在進行這方面的研究。Verheijden等[14]發現，HCgp-39能誘導BALB/C小鼠產生一種與RA極其相似的慢性復發性對稱性關節炎。在免疫反應之前將HCgp-39注射至BALB/C小鼠鼻腔內，可導致抗原特異的T細胞免疫耐受，進而延緩或抑制關節炎癥。Cope等[15]發現，HCgp-39刺激DRαβ*0401轉基因小鼠的T細胞增殖，同樣HCgp-39可以刺激HLA-DR4陽性的RA患者和健康對照者的T細胞增殖，而HLA-DR4陰性者則沒有這樣的反應。

本實驗針對HCgp-39 mRNA的啟動子下游序列，設計了兩段siRNA，運用分子克隆技術，成功構建兩段siRNA的真核表達載體并采用脂質體轉染入RA患者PBMC中，觀察其對 HCgp-39表達量及細胞增殖的影響。轉染24 h，與對照組和空載體組相比，HCgp39-siRNA1組和HCgp39-siRNA2組HCgp39 mRNA表達均下降，提示所設計的兩個載體阻斷了HCgp39 mRNA表達，載體構建成功。倒置顯微鏡下觀察發現，與對照組和空載體組相比，HCgp-39-siRNA1組與HCgp-39-siRNA2組細胞形態不規則，漂浮細胞增多，出現大量凋亡細胞團；HCgp-39-siRNA1組、HCgp-39-siRNA2組較對照組和空載體組細胞增殖明顯減弱，間接說明HCgp-39可促進RA患者PBMC增殖。

綜上所述，HCgp-39可促進RA患者PBMC增殖，HCgp-39作為炎癥和退行性變的可能自身抗原可以為準備開發的RA聯合靶標藥物提供底物，通過RNAi技術特異性阻斷HCgp-39表達可能從抗原特異免疫治療方面為RA的治療提供新的手段和方法。

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(收稿日期：2015-05-18)

中圖分類號：R684

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)04-0079-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.031