超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜法鑒定育發化妝品中4種植物功效成分

謝文緘,熊小婷,席紹峰,2,李慧勇,譚建華,2*,王繼才,

趙田甜1,郭長虹1

(1.廣州質量監督檢測研究院　國家化妝品質量監督檢驗中心(廣州),廣東　廣州　510611；

2.華南農業大學　資源環境學院,廣東　廣州　510642)

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超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜法鑒定育發化妝品中4種植物功效成分

謝文緘1,熊小婷1,席紹峰1,2,李慧勇1,譚建華1,2*,王繼才1,

趙田甜1,郭長虹1

(1.廣州質量監督檢測研究院國家化妝品質量監督檢驗中心(廣州),廣東廣州510611；

2.華南農業大學資源環境學院,廣東廣州510642)

摘要：建立了固相萃取/超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)鑒定育發化妝品中4種植物功效成分(槲皮苷、何首烏苷、蘆丁和柚皮苷)的分析方法。樣品采用甲醇超聲提取,上清液經2%/甲酸水溶液稀釋后上PAX陰離子固相萃取柱凈化。以甲醇和0.002%甲酸水溶液為流動相,梯度洗脫,在CSH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,Waters)上分離,于UPLC-QTOF-MS負離子模式下進行檢測。槲皮苷、何首烏苷和蘆丁采用外標法定量測定；5%氨水溶液條件下,柚皮苷因在PAX上的吸附過程中結構轉化為柚皮苷查爾酮,只能進行定性鑒定。在優化條件下,槲皮苷、何首烏苷和蘆丁在5~200 μg·L-1濃度范圍內均呈良好線性,相關系數大于0.999；方法定量下限(LOQ,S/N=10)為0.03~0.1 mg·kg-1；在洗發水基質中的加標回收率為80.9%~104.7%,相對標準偏差(n=6)不大19.6%。該方法準確、適用性強,已成功應用于育發化妝品中槲皮苷、何首烏苷和蘆丁的定性定量檢測以及柚皮苷的定性鑒定。

關鍵詞：固相萃取(SPE)；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)；育發化妝品；功效成分

隨著人們對脫發越來越重視,各類新型育發化妝品產品層出不窮。據查詢,目前在我國國家食品藥品監督管理局登記育發化妝品特證備案的國產化妝品有幾百種,其中大部分產品宣稱以中草藥植物提取液為主要功效成分。中草藥植物的育發機理存在傳統中醫和西方科學兩種研究理念。傳統中醫研究認為,中草藥如紅花、川穹等能活血行氣,祛風止痛；干姜等辛溫通絡,有助于藥物的透皮吸收；諸藥合用,則能改善頭部皮膚血液循環,改善毛發營養從而達到育發效果[1]；西方科學從細胞生物學角度研究植物提取液的育發機理,研究者[2-3]通過小鼠實驗證明了側柏、首烏等植物提取液具有誘發β-catenin和Sonic hedgehog蛋白,增加毛囊細胞的數量等作用；Park等[4]通過小鼠實驗證明了首烏提取液能抑制Ⅱ型5α還原酶產生。然而,由于缺乏相關功效檢測方法及鑒定技術,假冒偽劣、虛假宣傳等不良現象普遍存在,嚴重影響了消費者對于中草藥植物育發化妝品的信心。因此,為了督促企業加強產品質量控制,提升育發化妝品行業的質量水平,亟需建立相應的檢測方法標準對育發化妝品進行植物提取液功效成分的鑒定。

側柏、何首烏、骨碎補和桑葉是常見的中草藥植物,其育發作用已被大量研究所證實[1-10]。本研究依據中華人民共和國藥典第一部(2010版)[11],分別選擇槲皮苷、何首烏苷、柚皮苷和蘆丁作為與側柏、何首烏、骨碎補和桑葉的藥材或提取液相對應的功效成分(見表1)進行定性定量檢測方法的研究,并以此鑒定該類植物提取液在育發化妝品中的有效添加情況。目前,關于功效成分槲皮苷、何首烏苷、柚皮苷和蘆丁的檢測技術報道眾多,主要采用高效液相色譜法[12-15]和液相色譜-質譜聯用法等[16-20]?？紤]到育發化妝品中4種功效成分的含量較低,且其基質復雜,特別是育發洗發液類產品中含有大量的各類表面活性劑等基質,本研究采用固相萃取技術對樣品進行有效凈化,利用超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF)對樣品中的4種功效成分進行確證檢測,建立了快速、準確鑒定育發化妝品中槲皮苷、何首烏苷、柚皮苷和蘆丁的分析方法。

圖1　4種植物功效成分的分子結構

1實驗部分

1.1儀器、材料與試劑

超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜儀(美國Waters公司)；高速冷凍離心機(Allegra 64R,Beckman)；MS3 basic旋渦混合器(德國IKA公司)；BG-02C型超聲波發生器(廣州邦潔超聲設備有限公司)；24孔位固相萃取裝置(上海安譜有限公司)；超純水系統(Milli-Q,美國Millipore公司)；PVDF濾膜(直徑25 m,孔徑0.2 μm,美國Agilent公司)；HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,美國Waters公司);PAX固相萃取柱(500 mg/6 mL,美國Agilent公司)。

甲醇、乙腈(HPLC級,Fisher Scientific公司)；甲酸、氨水、磷酸氫二鈉(分析純,上海安譜公司)。

何首烏苷(THS-GLU)、柚皮苷(NG)、蘆丁(RT)、槲皮苷(QR)標準品(純度均大于99.0%,上海詩丹德生物技術有限公司)。

1.2標準溶液的配制

分別稱取10.0 mg標準品(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成1 g/L的單標標準儲備液。分別吸收適量標準儲備液,用50%甲醇水溶液配成所需濃度的系列混合標準工作溶液,4 ℃避光保存。

1.3樣品的制備與提取

準確稱取0.5 g 試樣(精確至0.001 g)于10 mL具塞比色管中,用甲醇定容至刻度后,于旋渦振蕩器上混合使樣品分散1 min,超聲提取15 min,取樣液于離心管中以10 000 r/min離心5 min。上清液用PVDF膜過濾后,準確量取1 mL,加入9 mL 2%甲酸水溶液,混勻,待固相萃取凈化。

1.4固相萃取凈化

PAX固相萃取柱先用6 mL甲醇、6 mL水活化平衡。將“1.3”制備的樣品溶液以不高于1 mL/min的流速通過萃取小柱后,依次用6 mL 5%氨水溶液和10 mL甲醇淋洗,用 2%甲酸甲醇溶液洗脫4次,每次3 mL。洗脫液于40 ℃水浴中氮吹至近干,加1 mL流動相復溶,過濾,待測。

1.5色譜-質譜條件

1.5.1色譜條件色譜柱：CSH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,美國Waters公司)；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：A為0.002%甲酸水溶液,B為甲醇；梯度洗脫程序：0~3 min,20%~40%B,3~5 min,40%~20%B。

1.5.2質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI),負離子模式；毛細管電壓：2.5 kV；萃取錐孔電壓：35 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣流速：600 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；四極桿采集質量數范圍：100~1 000 u。數據采集模式：棒狀(Centroid)；掃描采集時間：0.2 s；TOF運行模式：V模式；以200 pg/μL亮氨酸腦啡肽(m/z=554.261 5)溶液進行實時校準。

2結果與討論

2.1前處理條件的優化

育發化妝品特別是育發洗發產品中含有大量的表面活性劑(如十二烷基硫酸銨、月桂醇聚醚硫酸酯鈉等),這些表面活性劑非常容易電離,能在ESI源上與目標物競爭,從而造成嚴重的離子抑制。而且,由于表面活性劑的含量很高,易在液相進樣系統、色譜管路、色譜柱及離子源上殘留,造成質譜的持續污染。因此,此類樣品需經過凈化才能進入質譜分析。本研究擬采用固相萃取凈化的方法對育發化妝品進行處理。

2.1.1固相萃取小柱的選擇4種功效成分均具有酚羥基的苯環化學結構,顯示出弱酸性和弱反相保留能力(酸度系數pKa和脂水分配系數logP值見表1)。本研究比較了兩種不同填料類型的固相萃取小柱(HLB,PAX)的凈化效果。實驗結果顯示,反相保留為主的HLB小柱能同時對4種功效成分、陰離子表面活性劑和油脂進行保留,但無法將各雜質進行分離而去除；PAX柱屬于混合型強陰離子交換柱,同時具有強陰離子交換能力和反相保留能力。此4種功效成分的酚羥基在堿性條件下離子化成為較穩定的酚羥基負離子,可與PAX柱上的強陰離子交換樹脂進行弱吸附,并可通過甲醇淋洗萃取柱將中性、堿性的具反相保留的雜質(油脂等)去除。同時,樣品中常見的陰離子表面活性劑屬強陰離子表面活性劑,能在任何條件下與PAX柱發生強吸附。4種功效成分在酸性甲醇條件下被洗脫時,陰離子表面活性劑類雜質因仍在PAX柱上保留而被去除。因此,本研究采用PAX柱對樣品提取液進行凈化,取得了較好的去除基質效果。

比較了不同規格PAX柱(60 mg/3 mL,150 mg/6 mL和500 mg/6 mL)的凈化效果。實驗發現,由于離子交換柱的交換容量一般較小(約為0.6~0.9 meq/g),而洗發液中陰離子表面活性劑的含量可能達到5%甚至以上,導致在本方法的稀釋倍數下,陰離子表面活性劑在60 mg/3 mL和150 mg/6 mL PAX柱上因吸附過載而被洗脫。因此,本研究采用500 mg/6 mL的PAX柱進行試驗。

表1　4種植物功效成分及其化學性質

*based on the calculation with MarvinSketch 5.12.4(ChemAxon Ltd.,https://www.chemaxon.com)

圖2　不同上樣方式對4種目標物回收率的影響Fig.2　Influence of different sample-loading methods on recoveries of four compoundssample-loading method①:add 20 μL ammonia to 1 mL extraction solution of methanol,vortex and get it loaded; ②:add 1 mL 5%ammonia to 1 mL extraction solution of methanol,vortex and get it loaded;③:add 9 mL 5%ammonia to 1 mL extraction solution of methanol,vortex and get it loaded;④:add 9 mL 2%formic acid to 1 mL extraction solution of methanol,vortex,get it loaded,then add 9 mL 5%ammonia to the column

2.1.2固相萃取上樣方式的選擇本研究系統比較了樣品提取溶液在不同上樣方式下,4種功效成分在固相萃取小柱上的保留吸附行為。分別采用以下4種上樣方式：①取1 mL甲醇提取液加20 μL氨水,混勻上樣；②取1 mL甲醇提取液加1 mL 5%氨水溶液,混勻,上樣；③取1 mL甲醇提取液加9 mL 5%氨水溶液,混勻,上樣；④取1 mL甲醇提取液加9 mL 2%甲酸水溶液,混勻上樣后,萃取小柱上加5 mL 5%氨水鎖定。采用4種方式上樣后,PAX柱均再用甲醇淋洗,2%甲酸甲醇洗脫。圖2的加標實驗結果顯示,隨化學性質的不同,4種功效成分的回收率受上樣方式的影響情況不同。蘆丁和槲皮苷的pKa均為6.43(見表1),酚羥基酸性較強,在堿性條件下很容易失去1個質子形成穩定的酚羥基負離子,能與PAX填料發生較強的吸附,因此在4種上樣方式下均具有較理想的回收率。何首烏苷和柚皮苷的pKa值分別為9.20和9.32,logP值分別為0.83和-0.16,兩者的酚羥基酸性較弱。柚皮苷在含甲醇比例較高的上樣溶液(上樣方式①和②)中無法通過酚羥基負離子與PAX填料發生吸附而保留,在上樣過柱液和甲醇淋洗液中部分洗脫。因此,只能在含較低比例甲醇(10%)的上樣溶液(上樣方式③和④)中先通過反相保留吸附,再通過在氨水條件下離子化而鎖定在PAX填料上。何首烏苷的反相保留和離子交換吸附均略強于柚皮苷,在較高甲醇比例的上樣溶液(上樣方式①)中能大部分鎖定在PAX填料上。但隨著氨水溶液比例的增加,何首烏苷的回收率下降,在上樣方式③中的回收率降至45%,上樣過柱液和甲醇淋洗液中也未見何首烏苷被洗脫。嘗試增加洗脫溶液中甲酸的比例以及更換反相洗脫能力更強的酸化乙腈、二氯甲烷等溶劑進行洗脫均未成功。這可能是因為在有氨水的水溶液條件下,何首烏苷會與PAX填料發生某種不可逆的吸附,導致少量何首烏苷無法洗脫。這種吸附隨著氨水溶液比例的上升而增加。采用上樣方式④,由于同樣必須采用氨水鎖定,何首烏苷雖也有部分損失(回收率約為80%),但基本能夠滿足鑒定方法要求。因此,本研究采用上樣方式④進行實驗。

2.1.3柚皮苷在固相萃取小柱上的結構轉化實驗發現,加標樣品過PAX柱凈化后,柚皮苷的出峰時間發生偏移(如圖3),出峰時間由2.12 min推遲到2.66 min,但其質譜斷裂方式基本一致,碎片離子及豐度比未發生較大變化(如圖4)。通過串聯紫外檢測器對柚皮苷的兩個色譜峰進行紫外光譜分析,結果發現柚皮苷的紫外最大吸收由283 nm轉變為362 nm(如圖5)。參照文獻研究[21],分析柚皮苷的化學結構,其出峰時間和紫外光譜的變化可能是因為在氨水的作用下,在離子交換柱上的吸附過程中柚皮苷結構轉化為柚皮苷查爾酮(如圖6)。為了繼續查證柚皮苷結構轉化現象的原因,本實驗直接在柚皮苷標準溶液中加5%氨水溶液,混勻,靜置5 min后再進行測定。結果發現,只有少量的柚皮苷存在結構轉化現象,而只要通過PAX柱的吸附與解析,絕大部分的柚皮苷將發生結構轉化。該現象證實,在弱堿性條件下,柚皮苷在離子交換柱上的吸附能在一定程度上促進其發生結構轉化。通過進一步試驗比較,柚皮苷構型發生轉化后的質譜斷裂方式等質譜行為雖然變化較小,但整體的離子豐度比構型轉化前有了較大提升,可能是因為柚皮苷查爾酮的分子離子化效率更高?？紤]到柚皮苷結構的轉化率受各種實驗因素影響較大而很難量化,因此本研究只對柚皮苷進行定性鑒定,而不進行定量檢測。

圖3　4種功效成分過PAX柱前(A)、后(B)的提取離子質譜變化圖

2.2色譜-質譜條件的優化

2.2.1流動相的選擇4種功效成分在ESI-模式下具有較強的離子響應,因此在ESI-模式下對色譜和質譜參數進行了系統優化。由于4種功效成分的化學結構均具有多個酚羥基,因此,本研究選擇甲醇和水為流動相,且在水相中添加少量的甲酸以得到理想的色譜峰形。進一步試驗發現,水相流動相中的甲酸會對目標物產生離子抑制。比較了水相中不同濃度的甲酸水溶液(0.002%,0.005%,0.010%,0.020%,0.040%)對目標物的抑制情況。結果發現,隨著甲酸濃度的升高,4種功效成分的響應均呈下降趨勢。綜合考慮流動相的穩定性及方法靈敏度,采用甲醇-0.002%甲酸水溶液為流動相。

圖5　柚皮苷在PAX柱上洗脫前(A)、后(B)的紫外吸收光譜變化圖

圖7　錐孔電壓參數的優化Fig.7　Optimization of sample cove voltage

2.2.2質譜參數的選擇Q-TOF的質譜參數主要有毛細管電壓、錐孔電壓、萃取電壓、離子源溫度和霧化氣流量等,其中錐孔電壓對于不同目標物的靈敏度影響最大。Q-TOF一般采用全掃模式,因此無法針對每個離子對設置單獨的錐孔電壓。本研究以各功效成分的準分子離子峰[M-H]-為目標,在優化好其他質譜參數的條件下比較了不同錐孔電壓(25,35,45,55 V)條件下各準分子離子峰的響應豐度。結果顯示,4種功效成分的靈敏度受錐孔電壓變化的影響各不相同(見圖7)。綜合考慮4種功效成分的靈敏度差異,本研究選用錐孔電壓為35 V。

另外,本研究分別以準分子離子峰為母離子,通過優化碰撞電壓(Trap CE voltage),利用氬氣碰撞產生碎片離子進行二級質譜掃描,得到各化合物一個豐度最高的穩定碎片離子作為定性確證依據。表2列出了各化合物的質譜參數、保留時間、精確分子量以及通過MassLynx軟件中Elemental Composition計算分析得到的理論分子量和質量精確度。結果顯示,本研究得到的分子質量準確度非常高,能保證定性鑒定的準確性。

表2　4種功效成分的質譜參數、保留時間、精確分子量、理論分子量和質量精確度

(續表2)

CompoundQualitativeionRetentiontime/minElementalcompositionTrapCEvoltage/VAccurateMr/DaTheoreticalMr/DaError/mDAError/ppmRT[M-H]-2.19C27H29O166609.1437609.1456-1.9-3.1[M-H-C12H21O9]-C15H8O730300.0283300.02701.34.3QR[M-H]-2.35C21H20O116447.0930447.09270.30.7[M-H-C6H12O4]-C15H8O730300.0277300.02700.72.3

2.3線性關系與方法檢出限

分別配制質量濃度為5~250 μg·L-1的系列標準溶液,采用本方法對目標化合物進行測定,根據其色譜峰面積積分值(y)和相應質量濃度(x,μg·L-1)的響應關系,得線性回歸方程及相關系數(見表3)。結果表明,在5~250 μg·L-1范圍內,槲皮苷、何首烏苷和蘆丁的線性關系良好,相關系數(r2)均在0.999以上。本文采用基質樣品加標,通過計算其標樣的響應與背景噪音的比值(S/N=3)確定方法檢出限(LOD),以S/N=10確定方法定量下限(LOQ),結果見表3。

表3　目標物的線性方程、線性范圍、相關系數、方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)

2.4回收率與精密度

選用陰性洗發乳為加標基質,按本實驗條件進行0.1,1.0,2.0 mg/kg 3個加標水平的回收率與精密度實驗(表4)。結果顯示,THS-GLU,RT和QR在3個加標水平下的平均回收率為80.9%~104.7%,相對標準偏差(RSD)均不大于19.6%,能滿足育發化妝品中3種功效成分的鑒定要求。NG在結構轉化成柚皮苷查爾酮后,其整體的離子豐度比構型轉化前有了較大提升,但轉化率不穩定,隨著實驗條件及濃度不同而變化。在加標0.10 mg·kg-1水平下,平均回收率為121.1%；而在加標1.0 mg·kg-1水平下,平均回收率達到174.7%,回收率偏差太大且不穩定而導致無法進行準確定量。因此,本研究只對柚皮苷進行定性鑒定,而不進行定量檢測。

表4　回收率與精密度測定結果(n=6)

2.5實際樣品的測定

采用本方法對10份育發化妝品產品進行何首烏苷、柚皮苷、蘆丁和槲皮苷成分的鑒定檢測。10份樣品包括洗發乳、精華液等產品,其中7份產品標稱含有何首烏提取物,4份產品標稱含有側柏葉提取物,1份樣品標稱含有骨碎補提取物,1份樣品標稱含有桑葉提取物(部分產品同時標稱含有多種提取物),實際樣品的典型色譜圖見圖8。實驗結果顯示,與產品標簽宣稱進行比較,樣品中各功效成分的實際檢出率為：何首烏苷,29%；槲皮苷,50%；蘆丁和柚皮苷,100%；含量范圍為

3結論

本研究采用陰離子交換固相萃取技術結合超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF),建立了同時鑒定育發化妝品中槲皮苷、何首烏苷和蘆丁3種功效成分的定性定量檢測方法以及柚皮苷的定性鑒定方法。通過對固相萃取方法和質譜條件的優化,成功解決了育發洗發液中高含量表面活性劑所造成的基質干擾及污染問題,顯著提高了方法的靈敏度和適用性,該方法成功應用于市售中草藥育發化妝品的實際檢測工作。另外,本研究發現了弱堿性條件下(5%氨水溶液)柚皮苷在離子交換柱上的吸附過程中結構轉化為柚皮苷查爾酮的現象,從而為研究該類化合物的結構性質提供了新的理論依據。

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Identification of Four Active Constituents in Hair Growth Cosmetics byUltra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

XIE Wen-jian1,XIONG Xiao-ting1,XI Shao-feng1,2,LI Hui-yong1,TAN Jian-hua1,2*,WANG Ji-cai1,ZHAO Tian-tian1,GUO Chang-hong1

(1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,National Center for Quality Supervision and Testing of Cosmetics(Guangzhou),Guangzhou510611,China;2.The College of Natural Resources and Environment of South China Agricultural University,Guangzhou510642,China)

Abstract：A method for the determination of four active constituents(i.e.2,3,5,4′-tetrahydroxy stilbene-2-Ο-β-D-glucoside(THS-GLU),quercetin-3-rhamnoside(QR),rutin(RT)and naringin(NG))in hair growth cosmetics was developed by strong anion exchange-solid phase extraction(SPE) combined with ultra performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry(UPLC-QTOF-MS).The sample was ultrasonically extracted with methanol,and purified with SPE(PAX,500 mg/6 mL) cartridge.Chromatographic separation was conducted on a UPLC CSH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,Waters) column by gradient elution using methanol and 0.002%formic acid solution as mobile phases.The MS analysis was carried out in electrospray ionization operated in negative mode.THS-GLU,QR and RT were quantified by the external standard method.NG,which arised configuration conversion to naringin chalcone,was just identified by qualitative analysis.Under the optimal conditions,satisfactory linearities(r2>0.999) for three compounds were obtained for all analytes in the concentration range of 5-200 μg/L.Limits of quantitation(S/N=10) were in the range of 0.03-0.1 mg·kg-1.Recoveries at three spiked levels were in the range of 80.9%-104.7%with relative standard deviations(RSD,n=6) not more than 19.6%.This method was accurate and applicable,and was succcessfully applied in the determination of THS-GLU,QR,RT and the identification of NG in hair growth cosmetics.

Key words：solid phase extraction(SPE);ultra performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry(UPLC-QTOF-MS);hair growth cosmetics;active constituents

中圖分類號：O657.63；TQ658

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0164-08

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.006

*通訊作者：譚建華,高級工程師,研究方向：色譜、質譜檢測技術,Tel:020-83300529,E-mail:tanjianhua0734@aliyun.com

基金項目：廣州市質量技術監督局科技項目(2014KJ39)；國家質量監督檢驗檢疫總局公益性行業科研專項(2012104013-3)

收稿日期：2015-08-28；修回日期：2015-10-22