HIF-2對鐵代謝的調節及其研究進展*

孫朝君 綜述，耿 惠 審校

(1.青海大學研究生院 810000；2.青海大學附屬醫院血液科 810000)

HIF-2對鐵代謝的調節及其研究進展*

孫朝君1綜述，耿 惠2△審校

(1.青海大學研究生院 810000；2.青海大學附屬醫院血液科 810000)

缺氧誘導因子2；鐵調節蛋白質類；轉鐵蛋白；受體，轉鐵蛋白；鐵調節元件

據報道全世界有1億4千萬居民居于海拔2 500 m的地區，有1千7百萬人口居住于海拔3 500 m以上的地區[1]。在高海拔地區缺氧可導致許多癥狀，如貧血和機體將氧運輸到組織的能力降低。血紅蛋白是運輸氧的關鍵工具，它包含一個重要的微量元素-鐵。鐵對于許多生物過程如氧的運輸都是必不可少的，它的供給受到嚴格的調控。然而缺氧條件下的鐵代謝機制并未完全清楚。較早的研究表明，在缺氧環境下缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)是調節許多鐵調節蛋白如銅藍蛋白、轉鐵蛋白(Tf)和儲存形式的鐵蛋白轉錄的關鍵因子，而隨后的研究表示HIF-2才是在鐵代謝中發揮著重要作用的因子[2]。

1 HIF簡介

HIF是20世紀90年代初，在研究低氧誘導的促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)基因表達時，從細胞核提取物中發現的參與氧穩態失衡調節的一個核心調節因子。HIF是一種基本的螺旋-環-螺旋異源二聚體，在氧平衡及適應缺氧中扮演著重要的角色。HIF由α和β兩個亞基組成，其中α亞基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，α亞型受缺氧信號的調控，β亞基則在細胞內穩定表達。常氧情況下HIF-α持續合成，但半衰期不到5 min，即被迅速降解。HIF-α的氧依賴降解結構域(ODDD)中的脯氨酸殘基被氧及亞鐵離子依賴性的脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)羥化，從而增加HIF-α與腫瘤抑制蛋白(VHL)的親和力。HIF-α與pVHL-泛素-蛋白酶復合體結合，經泛素-蛋白酶途徑將HIF-α快速降解[3]。在缺氧及缺鐵狀態下，PHD羥化HIF-α的反應受阻，使其不易被降解，造成HIF-α在細胞內積聚，并由細胞質進入細胞核，與恒定表達的HIF-β結合形成二聚體，HIF與被招募入核的輔激活蛋白p300/CBP結合，形成DNA結合復合體，結合于缺氧反應元件(HRE)位點，促進低氧反應基因的轉錄，引起細胞對低氧的一系列適應性反應[4]。其中HIF-1是Semenza等于1991年在誘導肝癌細胞株Hep3B細胞核提取物中發現的一種轉錄因子，它在人體組織中廣泛表達，最初的研究表明HIF-1是低氧環境下調節EPO的主要調節因子，而隨后的研究發現HIF-2才是調節EPO的主要因子[5]。HIF-2最早是在1997年由Tian等[6]克隆出來的，由功能性HIF-2α亞基和結構性HIF-1β亞基共同組成的異源二聚體。其代謝途徑與HIF-1相似。HIF-2表達譜相對較窄，缺氧條件下，HIF-2在多種組織器官如內皮、肺、心、肝、腎、腦、腸、胰腺的特定細胞中穩定表達，主要負責調節腫瘤生長、細胞周期與維持干細胞多功能性等方面的基因。盡管HIF-1和HIF-2共享許多轉錄靶點，但某些基因和過程似乎沒有共同調節，例如無糖酵解似乎主要有HIF-1α調節，而EPO的合成和鐵代謝為HIF-2α的調節過程。HIF-3α亦廣泛表達于各組織，但其功能目前仍未清楚闡明。

2 鐵在常氧環境下的代謝機制

血清鐵的水平主要依賴于腸道由食物中攝取、血液運輸、衰老紅細胞被吞噬釋放出的鐵循環再利用及其他組織如肝臟儲存鐵的釋放。用于正常紅細胞生成的大多數鐵來源于衰老紅細胞被吞噬釋放出的鐵循環再利用。衰老紅細胞被巨噬細胞吞噬，釋放出血紅素鐵，經膜鐵轉運蛋白(FPN)轉運入血。膳食中的鐵主要吸收部位在十二指腸及空腸上段，三價鐵被十二指腸上皮細胞腸腔面的細胞色素B(DcytB)還原為二價鐵，隨后由二價金屬離子轉運蛋白1(DMT-1)轉運至細胞內。轉運至細胞內的二價鐵可以以鐵蛋白的形式儲存，或與基底面的FPN結合并轉運入血。FPN通過循環中的銅藍蛋白和基底膜上的亞鐵氧化酶將二價鐵氧化為三價鐵，才能與Tf結合，通過血液循環與肝細胞表面的Tf受體(TfR)結合并利用。小腸對鐵的吸收由多種信號通路共同調控，缺氧時通過HIF-2調節，腸上皮細胞的鐵量由鐵調節蛋白/鐵反應元件(IRP/IRE)調節，機體鐵量由鐵調素調節。

3 HIF-2對鐵調素的調節

鐵調素是由肝臟合成及分泌的抗菌多肽，由HAMP基因編碼。最早由Krause于2000年從人血中分離出來，鐵調素高表達于肝細胞，其表達受到鐵儲存、貧血、缺氧及炎癥等多種因素調節。HIF影響鐵調素的分子調控，進而影響鐵代謝。鐵調素被描述為“鐵穩態主要調節器”，它通過十二指腸上皮細胞影響著鐵的吸收，并且影響巨噬細胞和其他鐵輸出細胞鐵的釋放。而進一步與膳食鐵攝取沒有直接關系的一系列因子也影響著鐵調素的水平，如炎癥、紅細胞生成增多和缺氧。在2001年，人們發現當膳食中鐵負荷過載時，鐵調素就會過度表達，進而提出鐵調素也許是一種調節鐵穩態的重要調節器[7]。隨后的研究證明了以上的假設。鐵調素主要是通過與FPN結合來調節鐵穩態，FPN是十二指腸黏膜、巨噬細胞和胎盤合體滋養層惟一能將細胞內鐵轉運至細胞外的轉運體。鐵調素與FPN在細胞表面結合，使FPN內化并降解[8]。Nicolas等[9]發現缺氧時鐵調素表達降低，然而具體的生理及缺氧調控鐵調素的機制仍不十分清楚，且互相矛盾。在細胞培養和動物實驗研究中，以及紅細胞增多癥患者的臨床數據均支持鐵調素的合成涉及VHL/HIF/PHD軸這一概念[10]。然而鐵調素氧依賴的分子機制，尤其是HIF對其調節中所扮演的角色并不清楚。通過轉錄測定法對鐵缺乏小鼠進行遺傳研究提出肝細胞中活化的HIF-1可以通過低氧反應元件(HRE)依賴機制直接抑制鐵調素[11]。而這一論點存在爭議，且最近更多的體內試驗表明HIF并未起到直接抑制HAMP轉錄的作用。另一缺氧誘導鐵調素抑制的模型是通過鐵依賴信號途徑控制HAMP的轉錄。信號通過遺傳性血色素沉著病的患者體內突變產生的HFE基因、TfR1、TfR2或鐵調素調節蛋白(HJV)從而增加鐵調素的表達。體內研究表明HIF誘導弗林蛋白(一種蛋白原轉化酶)將HJV轉化為可溶性HJV，競爭骨形態發生蛋白6(BMP6)從而拮抗HJV對HAMP轉錄的信號轉導[12]。同樣的，跨膜絲氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)，即蛋白裂解酶-2，是一種鐵調素抑制劑，已被證實是由HIF調節的，并推測在缺氧環境下TMPRSS6可鈍化BMP6/HJV調節信號[13]。也有一些機械學說提出低氧抑制鐵調素，最簡單的模型是HIF-2增加腎臟EPO的生成和“紅細胞生成驅動”，從而間接抑制鐵調素。據推測，紅細胞生成增強一種骨髓發出的系統信號，導致鐵調素在肝臟受抑制，這樣就可以增加FPN在細胞膜表面表達，從而增加紅細胞生成所需的可利用鐵。這一信號的候選因子是生長分化因子15(GDF15)，受鐵和氧調控(依賴HIF)，屬于轉化生長因子超家族的成員[14]。Liu等[15]用基因方法抑制HIF激活EPO的合成，發現HIF對HAMP的抑制調節需要EPO誘導。EPO誘導與紅細胞生成增加及血清中高水平的GDF15有關。當紅細胞生成受到藥物抑制，即使血清中EPO處于高海拔地區HAMP水平仍不再受到抑制，提示EPO并非自己直接調節HAMP。研究證明HIF通過誘導EPO合成刺激紅細胞生成來抑制HAMP。而已有研究證明缺氧環境下HIF-2是調節EPO的主要因子。Mastrogiannaki等[16]使用敲除鐵調素基因的小鼠，將其腸細胞的HIF-2α刪除，發現可以明顯減緩組織鐵過載的程度，提示HIF-2在鐵調節方面起著重要作用。

4 HIF-2對DcytB及DMT-1的調節

鐵從腸腔向循環系統定向轉運需要一系列的精確調控，這一體系包括DcytB、DMT-1、FPN和輔助蛋白，在哺乳動物新陳代謝中維持鐵穩態。這一腸道轉運過程包含轉錄中HIF-2調節及轉錄后IRP/IRE調節。已有兩項獨立研究表明DcytB受HIF-2的轉錄調控。DcytB是哺乳類動物體內的一種血漿鐵還原酶，催化膳食中的三價鐵還原為二價鐵，隨后由DMT1轉運至細胞內。Shah等[2]發現當低鐵喂養小鼠兩周導致小腸鐵缺乏時，可導致 DcytB 和 DMT-1表達增加，從而增加鐵的攝入，與此同時HIF-2α活性增加而 HIF-1α基本不變。當HIF信號途徑被破壞時，鐵缺乏導致的DcytB和DMT-1表達增加的效應消失，造成機體鐵缺乏和貧血。Mastrogiannaki等[17]研究發現十二指腸上皮細胞處于缺氧狀態可避免 HIF-2α的降解，從而促進腸道內鐵的吸收，當特異性敲除HIF-2α基因時，可造成血清鐵水平降低和肝臟鐵減少，DcytB和DMT-1表達降低，但HIF-1α特異性敲除則沒有這種效應。兩項研究均表明 HIF-2α是參與調控小腸鐵吸收相關基因的表達和鐵攝取的重要因子。Luo等[18]應用Western blot及定量PCR方法研究DcytB與HIF-2的關系，發現HIF-2沉默時DcytB和DMT1的表達降低。研究結果亦進一步證明了HIF-2可上調DcytB和DMT1的表達。分析表明DcytB和DMT1都存在HRE序列，體外實驗證明這些序列都可與HIF-2α結合而使基因表達增加。前期研究已表明HIF對機體鐵代謝的調節受到VHL的影響，VHL通過對HIF-2α泛素化修飾而實現對HIF-2α含量的調節[19]。缺氧時氧及亞鐵離子依賴性的脯氨酸羥化酶對HIF-2α的羥基化修飾作用減弱，VHL無法進行泛素化修飾，HIF-2α活性增加，與HIF-β形成異源二聚體，同時在轉錄調節蛋白輔助下誘導 DcytB 和DMT1 基因表達，進而促進鐵吸收。

5 HIF-2對Tf、TfR的調節

Tf是一種由698個氨基酸組成的糖蛋白，他由肝細胞分泌至血漿，可以結合兩個三價鐵。Tf是脊椎動物血清中主要的鐵結合蛋白，未與鐵結合的Tf通常被稱為脫鐵運鐵蛋白。Tf與血漿中細胞膜上的TfR具有高親和力。低氧環境下Tf mRNA的表達受HIF依賴方式的調節，Tf的轉錄起始點上游的第3 300～3 600位點發現增強子中存在2個HRE，二者均可與HIF結合，但是3′端的HRE要比5′端的親和力低。在缺氧條件下HIF與Tf的HRE結合致使Tf的mRNA和蛋白的表達均增加[20]。TfR1和TfR2分別是由760個氨基酸和801個氨基酸組成的蛋白。TfR2可以與Tf結合，但是其親和力較TfR1要低得多。TfRs 包含一個位于細胞質中短的N端、一個獨立的跨膜區及一個位于細胞外的長的C端。一旦與載鐵的Tf結合，TfR便通過受體介導的內吞作用被內化，細胞核內較低的pH值將三價鐵還原為二價鐵，并釋放Tf。釋放的二價鐵通過DMT-1離開細胞核轉化為可利用形式的鐵蛋白、膜FPN、合成亞鐵血紅素或與非血紅素鐵結合蛋白結合。TfR1在缺氧環境下通過HIF依賴方式調節。在人類TfR1基因轉錄起始位點上游的增強子80～93堿基對之間存在HRE。單一的HRE突變可以使缺氧對TfR1的調節消失。另外，在人類TfR1 mRNA中發現存在5個IRE位點。當氧水平低時，IRP-1與TfR1中IRE的結合減少，然而IRP2與TfR1中IRE的結合增加[21]。所有的TfR1中IRE-IRP2相互作用的結果都是在低氧環境下穩定TfR1 mRNA及增加TfR1蛋白的表達。研究認為缺氧環境下穩定TfR1的生理意義是通過紅細胞增加鐵的攝取[22]，對于最佳的血紅蛋白及紅細胞生成至關重要。

有研究表明，HIF維持鐵穩態的直接靶器官包括Tf和TfR，后者與Tf具有高親和力[23]。Tf用于運輸三價鐵形式的血清鐵至靶器官，血紅蛋白合成消耗的鐵大部分來自血漿中的Tf，而這一過程需要紅系細胞膜表面TfR的高表達。研究表明在紅細胞分化時TfR水平急劇增加發生在轉錄水平，該研究通過調查小鼠白血病細胞中TfR啟動子活性劑及DNA-蛋白質結合來研究TfR的轉錄調節，發現TfR mRNA的啟動子區含有HRE，在低氧環境下可以與缺氧誘導因子結合，進而促進TfR的表達[24]。缺氧會誘導 HIF的表達量增加，進而通過調節這些鐵代謝蛋白參與調控鐵穩態[25]。缺氧條件下，TfR的表達調控呈現HIF依賴模式，說明 HIF可以通過調控TfR，進而調節鐵穩態。Rankin等[26]發現，在小鼠肝細胞中敲除HIF-2基因可使肝組織Tf表達水平顯著減低，提示HIF-2可能誘導Tf基因表達。雖然已有大量研究表明調節鐵代謝的主要是HIF-2，但是TfR在低氧環境下具體是由HIF-1調節還是由HIF-2調節目前尚不清楚。

6 HIF-2與IRP-1的相互調節

IRP-1的作用是作為細胞內鐵的傳感器，通過與相關蛋白mRNA的IRE結合，調控經典的鐵敏感基因表達，如TfR、鐵蛋白及DMT-1[27]。Ghosh等[28]將野生小鼠及敲除IRP-1基因小鼠的肺內皮細胞分別在低氧環境下培養，發現無論是正常鐵膳食還是低鐵膳食，敲除IRP-1基因的小鼠HIF-2α蛋白表達均明顯升高，然而mRNA水平卻未升高。HIF調控的一些靶點如內皮素-1、BMP等的表達也有增加。相反，HIF-1α在敲除IRP-1基因的小鼠肺內皮細胞中的表達并未改變。表明HIF主要的PHD降解通路并沒有改變。因此，HIF-2表達的改變并不是轉錄改變或降解通路改變導致的，有可能是IRP-1缺失導致翻譯抑制劑失活致HIF-2表達增加。HIF-2表達增加，從而使受HIF-2調控的靶基因包括EPO表達增加，因此紅細胞生成增加，導致紅細胞增多及組織內鐵重分布用于紅細胞的生成。HIF-2作為EPO的主要調節器，也受到缺氧、貧血及鐵狀況的調節，通過PHD2/VHL調節HIF-2的降解通路。有研究表明HIF-2α mRNA的5′端也含有非編碼區IRE，是一種莖-環結構，在細胞內鐵水平降低時與IRP-1結合[29]負向調節HIF-2，這反過來限制EPO的生成，從而調節低氧誘導紅細胞生成對鐵的可利用性。當低氧環境下紅細胞生成消耗鐵過多時，細胞內鐵降低，IRP與HIF-2 的mRNA 5′端非編碼區的IRE結合，抑制HIF-2的表達，進而減少EPO的合成，使紅細胞生成減少，從而減少鐵的消耗。隨后Luo等[30]通過培養哺乳類HepG2細胞并進行生物化學處理，研究IRP-1的調控在低氧環境下的潛在分子機制，發現在短暫缺氧環境下HepG2細胞內的IRP-1 mRNA及蛋白質水平均降低，且通過Genomatix MatInspector軟件分析得出IRP-1的5′調控區含有HRE，可與HIF-1結合進而通過HIF/HRE系統負調節IRP-1。表明低氧環境下HIF可以與IRP-1 5′調控區的HRE結合調節IRP的表達，進而調控鐵的代謝。但是這一研究發現僅在短暫缺氧時IRP受HIF的調控表達減低，而在長期缺氧時IRP mRNA水平是上調的。因此提出低氧環境下對IRP的調控可能存在兩種機制。低氧環境下HIF對IRP的調節機制至今仍未能闡明。

目前低氧環境下鐵代謝的調節機制尚未完全解釋清楚，有研究表明HIF-1為主要調節因子，也有研究證實HIF-2是調節鐵穩態的主要因子。且HIF對鐵代謝的調節通路也未清楚闡明。關于HIF-2對鐵代謝的調節機制還有許多問題尚待研究。

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青海省應用基礎研究計劃項目(2014-ZJ-720)。

孫朝君(1987-)，住院醫師，碩士，主要從事血液病學研究。

△通訊作者,E-mail:gh0227@sina.com。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.043

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1671-8348(2016)10-1414-04

2015-12-28

2016-01-19)