反相離子對(duì)色譜法同時(shí)測(cè)定黃柏八味片中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量

黃湘杰，朱 芹

（1．湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411100）

反相離子對(duì)色譜法同時(shí)測(cè)定黃柏八味片中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量

黃湘杰1，朱 芹2

（1．湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411100）

目的 建立同時(shí)測(cè)定黃柏八味片中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量的反相離子對(duì)色譜法。方法 色譜柱為Agilent C18柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0．5%磷酸溶液（用磷酸調(diào)pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0．2 g）－乙腈（65∶35），柱溫25℃，流速1．0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。結(jié)果 鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿進(jìn)樣量分別在0．204～1．020 μg和0．506～2．530 μg與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為100．18%和99．82%，RSD分別為0．14%和0．51%（n＝6）。結(jié)論 該法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，組分分離良好，可用于制劑的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；黃柏八味片；鹽酸小檗堿；鹽酸黃柏堿

黃柏八味片是由黃柏、梔子、甘草、紅花等8味藥材組方的中藥復(fù)方制劑，具有清熱涼血、固精功效，用于治療腎熱、尿路感染、尿中帶血、經(jīng)下過(guò)多等病癥。其執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ07192006，檢驗(yàn)項(xiàng)目為黃柏的薄層色譜鑒別和鹽酸小檗堿的薄層掃描含量測(cè)定，而鹽酸小檗堿在黃連、黃柏、三顆針?biāo)幉闹芯嬖冢云渥鳛楹繙y(cè)定指標(biāo)不具有專(zhuān)屬性。2010年版《中國(guó)藥典（一部）》中也將鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量作為控制黃柏質(zhì)量的指標(biāo)之一[1]。為更好地控制本制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全、有效，筆者采用反相離子對(duì)色譜法同時(shí)測(cè)定黃柏八味片中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量，該法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AUW－220D型電子天平（十萬(wàn)分之一，日本島津公司）；UV2501型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)為110713－201212，含量為 86．7%)、鹽酸黃柏堿對(duì)照品(批號(hào)為 111895－201202，含量為93．9%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；黃柏八味片（湖南興蒙制藥有限公司，批號(hào)為131201，140407，140910）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0．5%磷酸溶液（用磷酸調(diào)pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉 0．2 g）－乙腈（35∶65）[2－3]；流速：1．0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品、鹽酸黃柏堿對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL含鹽酸小檗堿0．040 8 mg、鹽酸黃柏堿1．011 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 mL，超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取缺黃柏黃柏八味片試樣（自制），照供試品溶液制備方法，得陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取2．2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間位置有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液和鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液5，8，10，15，20，25 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積 A為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，鹽酸小檗堿 Y＝2 000 000X＋25 852(r＝0．999 2，n＝6），鹽酸黃柏堿 Y＝101 786X＋1 549．3(r＝0．999 1，n＝6）。結(jié)果表明鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿進(jìn)樣量分別在0．204～1．020 μg和 0．506～2．530 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿峰面積的 RSD分別為0．5%和1．2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為131201）樣品，精密稱(chēng)取6份，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下測(cè)定。結(jié)果每片樣品中含鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿1．476 mg和 0．351 mg，RSD分別為 1．0%和 1．2%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定7次。結(jié)果鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量的 RSD分別為1．1%和1．5%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱(chēng)取已測(cè)定含量樣品（批號(hào)為131201，每片含鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿1．476 mg和0．351 mg），精密稱(chēng)定，除去糖衣，研細(xì)，取約0．5 g，置具塞錐形瓶中。再精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(0．461 9 g／L)、鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液(0．101 1 g／L)各3 mL，分別加入上述具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液。按擬訂色譜條件測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按擬訂方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg，n＝3)

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：采用二極管陣列檢測(cè)器于200～400 nm波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿于230 nm，265 nm，345 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)紫外吸收，而鹽酸黃柏堿最大吸收波長(zhǎng)為284 nm。故選擇 284 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

提取溶劑的選擇[4－5]：考察以甲醇、50%甲醇、鹽酸－甲醇（1∶100）為提取溶劑，結(jié)果鹽酸－甲醇（1∶100）酸性太大，不適合提取黃柏堿；甲醇、50%甲醇的極性偏小，也不適合提取極性較大的黃柏堿。經(jīng)比較超聲、回流2種提取方法，并設(shè)定不同的提取時(shí)間和不同的提取溶劑體積，最終確定最佳提取方式為加流動(dòng)相50 mL，超聲30 min。

流動(dòng)相的選擇：嘗試了乙腈－0．5%三乙胺－0．2%磷酸、乙腈－0．02 mol／L磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)pH 3．0)、0．5%磷酸溶液（用磷酸調(diào)pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0．2 g）－乙腈（35∶65）3種不同的流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈－磷酸緩沖鹽體系洗脫力強(qiáng)，其中反相離子對(duì)SDS的加入可以降低鹽酸黃柏堿的極性，延長(zhǎng)柱上保留時(shí)間并有效地防止拖尾并且峰形對(duì)稱(chēng)，分離度較好。故選擇后者為流動(dòng)相。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:286，附錄29．

[2]陳天朝，瞿來(lái)超．HPLC梯度洗脫測(cè)定黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J]．中醫(yī)研究，2011，24(4):23－25．

[3]張 莉，潘 超．高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定二妙丸中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J]．中藥新藥雜志，2011，20(22): 2 262－2 264．

[4]祝晨 ，林朝展，莫建霞，等．HPLC法測(cè)定黃柏藥材中鹽酸小檗堿與黃柏堿的含量[J]．中藥新藥與臨床藥理，2004，15(4): 262－264．

[5]朱 芹，黃湘杰．HPLC法同時(shí)測(cè)定三黃散中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量[J]．中國(guó)藥師，2014，17(8):1 432－1 434．

Simultaneous Determination of Phellodendrine Chloride and Berberine Hydrochloride in Huangbaibawei Tablets by Reversed Phase Ion－Pair Chromatography

Huang Xiangjie1,Zhu Qin2
(1．XiangTan Institute for Food and Drug Control,Xiangtan,Hunan,China 411400; 2．Xiangxiang People′s Hospital,Xiangtan,Hunan,China 411100)

Objective To establish the reversed phase ion－pair chromatography method for the determination of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride in Huangbaibawei Tablets．Methods The Agilent C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used．The mobile phase was acetonitrile－0．5% phosphoric acid solution,adjusted to pH 4 with phosphoric acid,each 100 mL added sodium dodecyl sulfate 0．2 g(65∶35)．The flow rate was 1．0 mL／min,the column temperature was 25℃ and the detection wavelength was 284 nm．Results The injection volume of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride were in good linear relationship with the peak area in the ranges of 0．204－1．020 μg and 0．506－2．530 μg．The average recovery rates were 100．18% and 99．82%,and the RSD were 0．14% and 0．51%(n＝6)．Conclusion The method is simple,accurate,with good separation of the 2 components,which can be used as the quality control of Huangbaibawei Tablets．

HPLC;Huangbaibawei Tablets;berberine hydrochloride;phellodendrine chloride

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)03－0052－03

黃湘杰，男，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治觯娮有畔洌﹝huqin1221＠163．com。

2015－03－18；

2015－09－10)