玉米品種快速鑒定技術研究發展及應用

玉米品種快速鑒定技術研究發展及應用

國以農為本，農以種為先，培育和生產優良種子是種業核心任務。目前玉米種子生產經營環節存在品種間同質化、套牌侵權等問題，快速準確的品種鑒定技術顯得尤為重要，是保護種子生產者和用種者合法權益的關鍵。

玉米品種鑒定技術大致可分兩類：大田形態鑒定和室內快速鑒定。傳統大田形態鑒定是以植株和葉、花、果實、花粉等器官的農藝性狀作為觀測指標進行鑒別，看似簡單明了，但在種植過程中對栽培技術、環境因素有著限制性要求，而且鑒定者的觀測經驗也制約著鑒定結果的準確性。近幾年，大量玉米新品種不斷涌現，相應增加了鑒定難度。另外，最難以解決的是這種方法周期長，沒有時效性，往往鑒定結果出來了，種子也賣到了老百姓的手中，甚至有時生長季也基本結束，對玉米種子質量起不到監控效果。

室內快速鑒定分為品種生化標記和分子標記兩種技術。分別在蛋白質和分子水平上對不同遺傳特性的品種予以鑒別。現就這兩種快速鑒定技術的基本原理及其在品種真實性和純度分析上的應用概況予以簡述。

一、生化標記鑒定技術

此項技術是以品種間生化差異為基礎的遺傳標記，是蛋白質分子水平上的多態性的直接反映。包括蛋白質電泳、同工酶電泳、高效液相色譜和抗體反應等方法。其中同工酶電泳、蛋白質電泳在玉米品種鑒定和純度檢測中得到了非常廣泛的應用。這種技術共同的優點就是操作簡單、快速、費用低，不需要高精度儀器設備，便于大規模的推廣使用。

1.同工酶電泳技術

不同玉米品種其同工酶的種類、數量、大小有差異，通過電泳能夠形成不同的酶譜，從而鑒定玉米品種的真實性和純度。最常用、多態性較強的是酯酶同工酶和過氧化物同工酶，這是目前應用較多的一種方法，但也有不足之處：一是由于同工酶是基因表達的最后產物，它不能完全顯示品種間的多態性，對于親緣關系比較密切的自交系及其雜交種難以鑒定。二是技術有一定的難度，從酶提取到電泳的整個過程必須保持較低的環境溫度，防止酶失去活性。

2.蛋白質電泳技術

不同玉米品種由于遺傳組成不同，其蛋白質在種類、數量、大小及結構等方面也不同，這樣就可以通過電泳形成不同的蛋白質譜帶，從而鑒別品種的真實性和純度，這種方法主要是指聚丙烯酰胺凝膠電泳法，非常成熟而且應用廣泛，已經在1999年山東省地方標準、2001年農業部行業標準進行推廣。

蛋白質電泳技術是目前玉米品種純度室內檢測使用最普遍的方法。蛋白質提取容易，無須低溫，需時較短，成分數量穩定，不受外界環境條件影響，不受種植區域、地力水平的影響，具有較高的準確性和廣泛的適應性。同時也應該注意到，蛋白質也是基因分子表達的產物，并不能完全顯示品種間的多態性，對一些親緣關系近的親本材料和雜交種之間不容易鑒別，限制了部分玉米品種真實性和純度鑒定，是這種鑒定技術最大的局限性。

二、品種分子標記鑒定技術

分子標記又稱DNA指紋鑒定。不同品種的遺傳物質基礎不同，其堿基組分、排列序列以及長度也不相同。它們就像人類的指紋一樣，具有專一性和特異性，被形象地稱為品種指紋。在玉米品種真實性、純度鑒定領域，將品種特異性基因片段組合（基因組）作為識別該品種的指紋，可以鑒別不同的玉米品種。

這項技術的發展使得玉米品種真實性和純度檢測由大田形態種植鑒定、生化標記鑒定邁入了分子標記水平。與前兩種方法相比，品種指紋鑒定不受環境影響、快速高效，能夠鑒別表型難于區別的品種。其他特點還包括：（1）可以標記的片段數量極多，遍及整個基因組，這是同工酶和蛋白質電泳技術無法比擬的。（2）是直接以基因組形式表現，無器官的特異性，各個生長發育階段均可鑒定。（3）是不受任何客觀因素的影響，有很高的準確性和穩定性。

品種指紋鑒定技術的發展經歷了三個重要的階段：20世紀90年代的第一代標記技術：限制性片段長度多態性標記、隨機擴增多態性標記和擴增片段長度多態性標記；21世紀初興起的第二代標記技術：簡單重復序列標記；近幾年啟動研究的第三代標記技術：單核苷酸多態標記。每種標記技術都在特定時期內對玉米品種鑒定工作發揮了一定的作用。

1.限制性片段長度多態性標記

這種技術是利用一種或幾種限制性內切酶消化基因分子，通過合成探針進行分子雜交，揭示基因多態性，能夠區分不同生物個體間基因的細微差異。由于玉米作物不同品種間能夠找到很多標記，利用某一品種特定基因可以準確地標記該品種，因而成為玉米品種檢測有效的手段和方法。其優點是多態性穩定，重復性好，準確性高，但操作程序煩瑣、周期長、成本高，且一般的種子檢驗部門不具有放射性同位素標記，所以此法不宜在種子生產部門、經營部門普及推廣。

2.隨機擴增多態性標記

利用隨機引物對不同品種的基因組進行擴增，再經電泳得到多態性的譜帶，從而鑒別不同的品種。具有操作簡單、經濟快捷、基因分子需要量少、靈敏度高等優點。但由于擴增的隨機性，一個引物只能檢測基因組的有限區域，有些引物不能分開親緣關系很近品種，必須擴充引物進行區分。因此，引物的篩選是一個非常煩瑣而漫長的操作過程，在方法推廣使用方面有很大的局限性。

3.擴增片段長度多態性標記

這是基于限制性酶切和擴增技術的標記，結合了兩者的特點，具有很高的可靠性和高效性，適合玉米基因型的指紋鑒定。具有多態性高、穩定性好、重復性強、準確性高等特點，但需放射性同位素和高精密的儀器設備，實驗人員必須具備較高的實驗技能，難以推廣使用。

4.簡單重復序列標記

第二代分子標記技術，又稱微衛星基因分子標記，是一類由1～5個核苷酸組成的短序列首尾相連重復多次構成的一段基因組。基因組經特定引物進行擴增后，不同大小的微衛星基因分子在高分辨力的測序凝膠或特殊瓊脂糖凝膠上電泳，獲得多位點、高分辨率的基因指紋圖譜。

2001年我國就啟動了這項技術在玉米品種鑒定的研發工作，隨著技術成熟，2007年頒布了玉米品種指紋鑒定的農業行業標準，確定40對玉米核心引物，同時建立了有近1.8萬個玉米品種指紋圖譜組成的數據庫，為玉米種子生產經營和監督管理提供了極大的方便。這種標記技術與其他標記技術相比，使用范圍最廣，其多態性豐富、信息含量高、分辨率好，具有較高的重復性；技術非常成熟，方法簡便易行，無須昂貴儀器設備，利于推廣。但這種標記技術，需要對位點進行分子克隆和分子序列分析，不同平臺間數據不能直接整合比較，需要設立參照樣品，這也給這項技術的應用帶來了一定的困難。

5.單核苷酸多態標記

第三代分子標記技術，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的序列多態性分析，所表現的多態性只涉及單個堿基的變異。這種標記技術作為最新的分子標記檢測方法，已被眾多國際組織，如國際種子檢驗協會、國際植物新品種保護聯盟、國際種子聯盟等推薦使用。杜邦先鋒、孟山都和先正達等國際一流農業公司也都采用了此標記對內部的育種材料和不同品種進行分類鑒定。2015年農業部印發《農作物品種DNA身份鑒定體系構建實施方案》，標志著我國品種鑒定將采用此項技術。這項技術基本可以全程自動化操作，但儀器設備所用資金較大，不利于推廣使用。

三、展望

總體來看，我國玉米品種鑒定技術的發展經歷了由田間地頭到實驗臺、所需時間由一個生長季縮短為幾個工作日，鑒定對象由整個植株微觀到基因分子，技術的使用也由科研院校普及到廣大種子生產經營者，這是了不起的進步。上述幾種方法各有其優缺點，但是分子標記技術是發展的大方向，可供選擇多，準確性高，不受環境影響等；它也有各種各樣的不足，如所需儀器精密、設備昂貴、費用較高、程序復雜，對實驗人員也有很高的技術要求等。不過隨著分子生物學技術的飛速發展，隨著品種指紋標記技術的不斷完善，這種先進的技術手段最終會直接服務于農業生產的各個方面，為我國現代種業發展保駕護航。

（胡昕山東省種子管理總站）