反丁烯二酸酯類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)與抑菌性能關(guān)系

邱松山，姜翠翠，周如金，劉杰鳳

（廣東石油化工學(xué)院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東 茂名 525000）

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反丁烯二酸酯類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)與抑菌性能關(guān)系

邱松山，姜翠翠，周如金，劉杰鳳

（廣東石油化工學(xué)院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東 茂名 525000）

摘要：采用密度泛函理論（DFT）考察反丁烯二酸酯類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與抑菌活性之間的定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）。在B3LYP/6-311++ G(d)基組下對(duì)13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化和頻率計(jì)算，選取最高占據(jù)軌道能量EHOMO、最低空軌道能量ELUMO及兩者的絕對(duì)差值?E、偶極矩(μ)、零點(diǎn)能、平均分子極化率(p)等量化參數(shù)作為量子化學(xué)描述符，通過(guò)多元逐步回歸分析篩選影響抑菌活性的主要因素并建立化合物量化參數(shù)和抑菌活性之間的QSAR模型方程，并用留一法交叉驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力。結(jié)果表明反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑制枯草芽孢桿菌性能與其結(jié)構(gòu)參數(shù)?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關(guān)系，?E和μ越大，抑菌活性越大，相關(guān)系數(shù)R=0.957，此類(lèi)化合物抑制枯草芽孢桿菌活性的理論值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性良好，表明該模型能較好的預(yù)測(cè)此類(lèi)具有α,β-不飽和羰基母體結(jié)構(gòu)的反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性。

關(guān)鍵詞：反丁烯二酸酯類(lèi)化合物；構(gòu)效關(guān)系；抗菌活性；計(jì)算機(jī)模擬；構(gòu)型優(yōu)化；外部預(yù)測(cè)

反丁烯二酸酯類(lèi)防腐劑是目前使用非常廣泛的一類(lèi)抑菌劑，具有使用方便、無(wú)殘毒、生產(chǎn)成本低、價(jià)格便宜等特點(diǎn)，是目前飼料、谷物較為理想的防霉抑菌劑。具有α,β-不飽和羰基母體結(jié)構(gòu)的反丁烯二酸單甲酯（MMF）、反丁烯二酸二甲酯（DMF）、反丁烯二酸單乙酯（MEF）、反丁烯二酸單丁酯（MBF）、反丁烯二酸單辛酯（MOF）等抑菌作用突出[1]。食品防腐劑分子結(jié)構(gòu)與活性之間關(guān)系的研究一直是一個(gè)受關(guān)注的課題，研究表明通過(guò)對(duì)不同濃度的MMF、MEF、MBF的抑菌效果的比較，5種反丁烯二酸單酯對(duì)11種常見(jiàn)霉菌都有一定的抑菌作用，其中對(duì)青霉的抑菌效果較好，對(duì)木霉、曲霉、根霉也有較好的抗菌效果[2]。周常義等[3]研究表明，離子型反丁烯二酸單甲酯對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為 0.06g/L，現(xiàn)有的研究均表明非對(duì)稱(chēng)反丁烯二酸酯類(lèi)是一類(lèi)具有良好防霉抗菌性能的化合物，對(duì)霉菌、酵母菌具有較好的抗菌效果。

防腐劑的抑菌性能本質(zhì)上取決于化合物的量子生物化學(xué)特性，探討反丁烯二酸酯類(lèi)防腐劑的量子化學(xué)與抑菌活性之間的關(guān)系及其抑菌機(jī)制有著重要的理論意義和實(shí)踐意義[4-5]。定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）的發(fā)展非常迅速，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)學(xué)模型定量描述化合物的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和活性之間的關(guān)系，從而能夠建立化合物結(jié)構(gòu)與活性-性質(zhì)之間的數(shù)學(xué)模型[6]。邱松山等[7]分析了具有抗菌活性的11種對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)化合物的定量構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果表明化合物的最低空軌道能量、偶極距和極化率是影響對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)化合物抗菌活性的主要因素。郭新竹等[8]對(duì)丁烯二酸酯類(lèi)分子的偶極矩、能量等量子生物化學(xué)特性進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)17種含α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)的分子連接性指數(shù)與抗菌活性進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明抑菌效果與抑菌劑的分子前線軌道能量的絕對(duì)值成反比，抑菌能力與抑菌劑的最高占有軌道能量呈顯著的直線回歸關(guān)系，且不飽和結(jié)構(gòu)及其雜原子在發(fā)揮抗菌功能中起著重要的作用。周如金等[9]對(duì)目標(biāo)化合物分子的量子化學(xué)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，結(jié)果表明含α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)的化合物周邊的分子碎片對(duì)抗菌活性影響較大。ZHU等[10]和TRESADERN等[11]分別通過(guò)對(duì)含α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)的防腐劑分子的拓?fù)鋮?shù)和量子化學(xué)參數(shù)進(jìn)行線性回歸，獲得此類(lèi)化合物的定量結(jié)構(gòu)與抑菌活性之間的QSAR關(guān)系模型，該模型表明此類(lèi)防腐劑持久的抑菌性能主要取決于防腐劑容納電子的能力，因此探討反丁烯二酸酯類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與生物活性的QSAR模型可大大增加對(duì)其分子抑菌活性機(jī)制的解釋?zhuān)瑥亩鵀楦咝У囊志鷦╅_(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。本文采用Gaussian 09軟件對(duì)13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的分子構(gòu)型進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化與頻率分析，在6-311++G(d)基組的水平下對(duì)其分子和相應(yīng)的基團(tuán)進(jìn)行計(jì)算，用密度泛函理論（DFT）建立反丁烯二酸酯類(lèi)化合物量化參數(shù)和抑菌活性之間的QSAR模型，在穩(wěn)定構(gòu)型下得到反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抗大腸桿菌活性間的構(gòu)效關(guān)系，為研究新型高效反丁烯二酸酯類(lèi)抑菌物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

756PC分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司，SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，LS-50HD數(shù)顯壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；NRY-1102C立式恒溫?fù)u床，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，F(xiàn)E20K酸度計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜等為分析純?cè)噭Ｈ飧唷⒌鞍纂恕傊鄣葹樯噭凰盟疄槿ルx子水，滅菌后使用。

1.2 最低抑菌濃度（MIC）分析

供試菌種：枯草芽孢桿菌（B. subtilis ATCC 6633）：由廣東石油化工學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，菌種使用前在固體培養(yǎng)基上活化一次。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.5%，pH=7.0～7.2。細(xì)菌固體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基則添加2%的瓊脂，培養(yǎng)基在使用之前121℃滅菌20min，待用。

供試的15種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物如表1所示，使用前配成1.00mg/mL溶液。

菌懸液的制備：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）在30℃培養(yǎng)24h，之后稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋∣D625nm= 1.1～1.3），用培養(yǎng)基將菌懸液以1∶50稀釋至最終濃度104CFU/mL。

最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定：參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，將反丁烯二酸酯類(lèi)樣品溶于DMSO中，倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤刖鷳乙褐校怪罱K濃度為1.00mg/mL，37℃恒溫培養(yǎng)48h，DMSO在培養(yǎng)基中的最終濃度不超過(guò)2%，強(qiáng)光清澈透明、無(wú)可見(jiàn)微生物生長(zhǎng)，化合物最低濃度即為MIC，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 反丁烯二酸酯類(lèi)化合物一覽表

1.3 量化方法和量化參數(shù)

采用Gaussian 09量子化學(xué)程序包[13]中的密度雜化泛函B3LYP方法，在6-311++ G(d)基組下優(yōu)化13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的幾何構(gòu)型和頻率計(jì)算，選取主要反映分子特征結(jié)構(gòu)的最高占據(jù)軌道能量EHOMO、最低空軌道能量ELUMO及兩者的絕對(duì)差值?E作為表征分子間相互作用的參數(shù)，選取衡量分子極性的偶極矩(μ)、零點(diǎn)能（zero-point energy，ZPE）、平均分子極化率(p)等6個(gè)量化參數(shù)研究反丁烯二酸酯類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與抑菌活性之間的關(guān)系，幾何構(gòu)型優(yōu)化均收斂，經(jīng)頻率分析表明無(wú)虛頻。反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抗菌最低抑菌濃度lg(1/MIC)及量子化學(xué)參數(shù)值見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 量化參數(shù)選擇

選取13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的lg(1/MIC)作為活性參數(shù)，應(yīng)用SPSS軟件分析相關(guān)化合物的抑菌活性lg(1/MIC)與量化計(jì)算所得的參數(shù)之間的相關(guān)性，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑菌活性lg(1/MIC)與?E、μ、p、ZPE等的相關(guān)系數(shù)較大，與ZPE成負(fù)相關(guān)，與?E、μ成正相關(guān)。

2.2 定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）

QSAR研究主要從化合物結(jié)構(gòu)出發(fā)，結(jié)合生物活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立二維或多維函數(shù)關(guān)系，揭示分子結(jié)構(gòu)與其活性間的構(gòu)效關(guān)系，從而為新分子的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)[14]，本文在95%置信區(qū)間內(nèi)應(yīng)用SPSS軟件對(duì)抑菌活性和量化參數(shù)進(jìn)行逐步回歸分析，獲得抑菌活性lg(1/MIC)和各量化參數(shù)之間的最佳模型方程。

表2 B3LYP/6-311++G(d)基組下反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性及量化參數(shù)

表3 反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性與量化指數(shù)的相關(guān)系數(shù)

lg(1/MIC) = 30.578×?E+0.014×μ?0.019×ZPE

R=0.957，R2=0.916，R2aj=0.929，F(xiàn)=32.099，n=13，Sig.<0.000

由該QSAR方程可知，所研究的反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性lg(1/MIC)與其結(jié)構(gòu)參數(shù)?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關(guān)系。?E和μ越大，抑菌活性越大，相關(guān)系數(shù)R=0.957，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)此類(lèi)具有α,β-不飽和羰基母體結(jié)構(gòu)的反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性。

2.3 分子結(jié)構(gòu)對(duì)抑菌活性的影響

研究表明反丁烯二酸酯類(lèi)防腐劑抑菌作用依賴(lài)于化合物基團(tuán)的空間立體特性，只有化合物抑菌活性中心與微生物生命分子的活性功能域發(fā)生有效接觸，反丁烯二酸酯類(lèi)化合物才能發(fā)揮抗菌作用。在分子間的自由碰撞過(guò)程中，化合物反應(yīng)活性中心周?chē)臻g位阻愈小，抑菌活性中心原子發(fā)生有效碰撞的概率就愈大，其抗菌活性相對(duì)愈強(qiáng)[8，15]。寧正祥等[15]研究表明，反丁烯二酸酯類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中含有α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)，具有電子中繼系統(tǒng)且羰基電子與相鄰烯鍵電子間形成共軛效應(yīng)，具有強(qiáng)的電子緩沖能力；此外，反丁烯二酸酯類(lèi)的抑菌活性比相應(yīng)的順式構(gòu)型的丁烯二酸酯類(lèi)高幾倍，表明影響抑菌劑抑菌效果發(fā)揮的首要因素是空間位阻效應(yīng)，并決定了抑菌劑分子中的反應(yīng)活性中心直接與菌體中的受體部位發(fā)生有效碰撞的頻率占抗菌劑分子與受體總碰撞頻率的比例[16]有關(guān)。能量最高的占據(jù)軌道HOMO和能量最低的空軌道LOMO統(tǒng)稱(chēng)為前線分子軌道，不同化合物分子參與反應(yīng)的HOMO與LUMO的能量越接近，相互作用越強(qiáng)，體系就越穩(wěn)定；HOMO和LUMO重疊越大，分子間形成的鍵就越牢固，化合物表現(xiàn)出的生物活性就越大[11，17]。反丁烯二酸酯類(lèi)化合物分子中電子得失和轉(zhuǎn)移能力主要取決于HOMO和LUMO能量，不同分子的抑菌活性受能量差?E的影響較大，此類(lèi)化合物中羧基酯化后親脂性比母體分子增強(qiáng)，其抑菌性能與化合物的分子結(jié)構(gòu)有較大關(guān)聯(lián)，抑菌性能本質(zhì)上取決于防腐劑與微生物作用時(shí)的電子行為，由所建立的QSAR方程可知，反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性與分子的?E和μ呈正相關(guān)性，在反丁烯二酸類(lèi)物質(zhì)的骨架引入極性供電子基對(duì)分子發(fā)揮抑菌作用是有利的，這為更具抑菌活性的反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

2.4 QSAR模型驗(yàn)證

反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑菌活性lg(1/MIC)實(shí)驗(yàn)值與理論值的相關(guān)性及殘差如圖1和圖2所示。由圖1、圖2可知，化合物抑菌活性lg(1/MIC)理論值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性良好，且其殘差值以0為中心符合正態(tài)分布。

采用方差膨脹因子（VIF）[7]評(píng)價(jià)所建立的QSAR模型中各自變量的共線性，結(jié)構(gòu)參數(shù)?E、μ、ZPE的平均VIF為2.976，表明樣本對(duì)回歸模型結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性影響較小，相關(guān)參數(shù)的選取可靠。

2.5 QSAR模型的外部預(yù)測(cè)

圖1 lg(1/MIC)理論值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性

圖2 13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物lg(1/MIC)殘差分布

選取所測(cè)13種以外的2種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物GMF和GAMF對(duì)所建立的QSAR模型進(jìn)行外部預(yù)測(cè)，GMF和GAMF抑菌活性lg(1/MIC)采用1.2節(jié)的方法進(jìn)行，分析計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的殘差結(jié)果如表4所示，計(jì)算值與測(cè)定值基本符合。

表4 根據(jù)模型計(jì)算所得數(shù)據(jù)和殘差表

3 結(jié) 論

在B3LYP/6-311++G(d)水平上對(duì)具有抑菌活性的13種反丁烯二酸酯類(lèi)化合物進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化和頻率計(jì)算，逐步回歸分析篩選影響抗大腸桿菌活性的主要參數(shù)，建立反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑制枯草芽孢桿菌的QSAR方程：

lg(1/MIC) = 30.578×?E+0.014×μ－0.019×ZPER2=0.916，R2aj=0.929

反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑制枯草芽孢桿菌活性lg(1/MIC)與其結(jié)構(gòu)參數(shù)?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關(guān)系，?E和μ越大，化合物抑菌活性越大，所建立的模型驗(yàn)證表明反丁烯二酸酯類(lèi)化合物抑制枯草芽孢桿菌活性lg(1/MIC)的理論值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性良好，該模型能較好地預(yù)測(cè)此類(lèi)具有α,β-不飽和羰基母體結(jié)構(gòu)的反丁烯二酸酯類(lèi)化合物的抑菌活性。

參 考 文 獻(xiàn)

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研究開(kāi)發(fā)

Relationship between antibacterial activity and structure of fumaric acid esters

QIU Songshan，JIANG Cuicui，ZHOU Rujin，LIU Jiefeng
（Development Centre of Technology for Fruit & Vegetables Storage and Processing Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China）

Abstract：The quantitative structure-activity relationship (QSAR) between molecular structures and antibacterial activity of fumaric acid esters was studied using the density functional theory (DFT) at the B3LYP functional at the level of 6-311++G(d) basis set. The energy of the highest occupied molecular orbital EHOMO，the energy of the lowest unoccupied molecular orbital ELUMO，the difference of energy ?E，the dipole moment μ，the zero-point energy (ZPE) and the average molecular polarizability (p) were selected as the structural descriptors. The geometries and the QSAR model of the samples were optimized and the stable complexes were obtained. The stability and predictive ability of the model were examined by the “l(fā)eave-one-out” cross-validation method．The results suggest that the dipole moment μ，?E and zero-point energy are the predominant factors affecting the antibacterial activity against B. subtilis. The antifungal activity increases with the increase of ?E and μ. The obtained QSAR model has a good stability and predictive ability for such inhibitors.

Key words：fumaric acid esters; structure-activity relationship; antibacterial activity; computer simulation；structure optimization; outer prediction

收稿日期：2015-06-17；修改稿日期：2015-09-01。基金項(xiàng)目：廣東省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2013B090600032）、茂名市科技計(jì)劃（2014007）及果蔬加工與貯藏工程中心開(kāi)放基金（2015A005）項(xiàng)目。第一作者：邱松山（1978—），男，博士，副教授。聯(lián)系人：周如金，博士，教授。E-mail tustqss@163.com。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.03.035

中圖分類(lèi)號(hào)：TS 201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）03–0879–05