肝細(xì)胞癌多基因甲基化研究

程越，張長(zhǎng)松，郭獻(xiàn)靈，衛(wèi)立辛河源市人民醫(yī)院，廣東河源57000；第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，上海00433

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肝細(xì)胞癌多基因甲基化研究

程越1，張長(zhǎng)松2，郭獻(xiàn)靈2，衛(wèi)立辛21河源市人民醫(yī)院，廣東河源517000；2第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，上海200433

摘要：目的通過研究肝癌中多基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，說明抑癌基因甲基化在肝癌發(fā)生的普遍性。方法分別抽提凍存的肝癌、癌旁組織和正常肝組織的DNA，利用亞硫酸氫鈉具有使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)為尿嘧啶而不改變甲基化胞嘧啶的特性分別設(shè)計(jì)甲基化引物和非甲基化引物，然后分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。我們分別檢測(cè)了轉(zhuǎn)移抑制基因p15, SYK, TIMP-3, E-cadherin, RASSAF1和腫瘤相關(guān)基因p53, RB1, WT1, p14, p16啟動(dòng)子區(qū)在60個(gè)肝癌、癌旁和6個(gè)正常肝組織的甲基化情況。結(jié)果60個(gè)肝癌標(biāo)本中10個(gè)基因的甲基化情況各不相同：從p53的8%~90%的RASSAF1；肝癌組織比癌旁組織的甲基化平均水平高，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.05）。結(jié)論肝癌中有多個(gè)基因存在甲基化，且肝癌組織甲基化水平較癌旁組織高。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；基因；甲基化

肝細(xì)胞癌(HCC,簡(jiǎn)稱肝癌)是全球常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤死因的第3位，且在世界范圍內(nèi)呈逐年上升之勢(shì)［1］。肝細(xì)胞癌的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。HCC的病因復(fù)雜，可能和病毒性肝炎（HBV、HCV）、肝硬化、黃曲霉毒素、酒精和飲用水污染等有關(guān)。目前認(rèn)為，HCC同其它惡性腫瘤一樣，它的形成是個(gè)多因素、多階段的過程。肝細(xì)胞癌的形成也是由于正常肝細(xì)胞在多種致癌因素影響下，因遺傳（基因突變、雜合性缺失LOH、基因多態(tài)性等）和表觀遺傳學(xué)改變（DNA甲基化和染色質(zhì)組蛋白的修飾等）的累積效應(yīng)而導(dǎo)致的，包括染色體不穩(wěn)定性、癌基因表達(dá)激活、抑癌基因沉默及DNA修復(fù)系統(tǒng)失活等［2-3］。表觀遺傳指在不影響DNA序列的情況下改變基因的表達(dá)，又稱為“表觀遺傳修飾”。表觀遺傳修飾主要從以下3個(gè)層面參與基因的表達(dá)調(diào)控。（1）DNA修飾：DNA共價(jià)結(jié)合1個(gè)修飾基團(tuán)，使具有相同序列的等位基因處于不同的修飾狀態(tài)；（2）蛋白修飾：通過對(duì)特殊蛋白修飾或改變蛋白的構(gòu)象實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控；（3）非編碼RNA的調(diào)控：RNA可通過某些機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控以及對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，如RNA干擾（RNAi）［4-5］。在腫瘤細(xì)胞分化和增殖中，基因突變、DNA甲基化紊亂表達(dá)、LOH缺失是導(dǎo)致癌基因和抑癌基因調(diào)控紊亂的主要原因，而DNA甲基化作為非常重要的表觀遺傳機(jī)制，均參與上述調(diào)控過程，在腫瘤的形成中發(fā)揮潛在作用［6］。

DNA甲基化常見于細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物，原核生物可產(chǎn)生3種甲基化堿基：N-6甲基化腺嘌呤、N-4甲基化胞嘧啶、C-5甲基化胞嘧啶；但在高等真核生物中僅發(fā)現(xiàn)C-5甲基化胞嘧啶。在哺乳動(dòng)物基因組中，DNA甲基化是指胞嘧啶和鳥嘌呤（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化。此過程是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的催化下［7］，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子上。哺乳動(dòng)物基因組有5%~10%是CpG位點(diǎn)，其中70%~80%為甲基化CpG（methCpG）。

通常腫瘤細(xì)胞的DNA會(huì)發(fā)生整體低甲基化和一些基因的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島高甲基化，尤其是一些抑癌基因。DNA甲基化在很多種腫瘤可以作為惡性度、活性和預(yù)后判斷的非常有用的指標(biāo)［8-9］。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化現(xiàn)象，這些基因包括有細(xì)胞周期調(diào)控基因比如p15、p16、p14；DNA修復(fù)基因hMLH1；細(xì)胞黏附基因E-cadherin，TIMP-3；解毒基因GSTP1；激素受體ER等［10］。高甲基化常常會(huì)抑制這些基因的表達(dá)，會(huì)引起細(xì)胞周期紊亂，使細(xì)胞惡性增殖；增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲力和惡性度，使腫瘤細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的起始階段發(fā)揮很重要的作用。

1　對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

本課題的研究對(duì)象為從2005年1~6月手術(shù)的肝癌病人，包括有49個(gè)男性和11個(gè)女性，年齡33~74歲，平均年齡為54.4歲，所有病人都通過H&E及免疫組化確診。48例已經(jīng)發(fā)生肝硬化，56例病人是乙型肝炎或者丙型肝炎抗原陽性的。

1.2方法

1.2.1組織中DNA提取從液氮中取出黃豆大小的組織碾碎，采用經(jīng)典的酚氯仿異戊醇法提取組織中全基因組DNA，提取后的基因組DNA用微量核酸定量?jī)x測(cè)定其濃度和純度后-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)表1設(shè)計(jì)并合成p14、p15、p16、RB甲基化和非甲基化引物各1對(duì)，所有引物由上海捷瑞工程有限公司合成，表1。

表1　基因甲基化和未甲基化引物

1.2.3甲基化修飾采用改進(jìn)的Herman法對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾。修飾后的DNA室溫干燥，并加入雙蒸水溶解。-60℃保存或直接進(jìn)行擴(kuò)增。MSP擴(kuò)增條件如下：95℃6 min 1個(gè)循環(huán)，95℃30 s，55℃60 s，72℃60 s 40個(gè)循環(huán)，最后72℃6 min 1個(gè)循環(huán)。

1.2.4結(jié)果判斷PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖電泳溴化乙錠染色檢測(cè)，用DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶為陽性擴(kuò)增。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

采用MSP法分別檢測(cè)5個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和5個(gè)腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)移抑制基因p15，SYK，TIMP-3，E-cadherin，RASSAF1和腫瘤相關(guān)基因p53，RB1，WT1，p14，p16啟動(dòng)子區(qū)在60個(gè)肝癌、癌旁和6個(gè)正常肝組織的甲基化情況。10種基因在60例肝癌組織，60例癌旁組織和6例正常肝組織中MSP代表性的結(jié)果見圖1。

研究發(fā)現(xiàn)這些基因啟動(dòng)子區(qū)在肝癌中甲基化情況各相同分別是SYK 43%，TIMP-3 43%，E-cadherin 45%，p15 38%，RASSAF1 88%，p53 8%，RB1 25%，WT1 48%，p14 90%，p16 50%。

我們發(fā)現(xiàn)癌組織的平均甲基化水平明顯高于癌旁組織，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，圖2）。我們認(rèn)為在肝癌組織中基因的高甲基化情況存在，而且較周圍癌旁組織的甲基化的數(shù)目多，因此我們推測(cè)多基因甲基化在肝硬化向肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮非常重要的作用。

3　討論

在肝癌發(fā)生過程中存在著多種抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化現(xiàn)象，這些基因包括有細(xì)胞周期調(diào)控基因比如p15、p16、p14；DNA修復(fù)基因hMLH1；細(xì)胞黏附基因E-cadherin，TIMP-3；解毒基因GSTP1；激素受體ER等。高甲基化會(huì)抑制這些基因的表達(dá)，會(huì)引起細(xì)胞周期紊亂，使細(xì)胞惡性增殖；增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲力和惡性度，使腫瘤細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移,在肝癌發(fā)生發(fā)展的起始階段發(fā)揮很重要的作用［11］。

我們檢測(cè)了10個(gè)腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，啟動(dòng)子區(qū)的甲基化頻率從p53的8%到p14的90%，大量研究提示肝癌中啟動(dòng)子區(qū)甲基化是很常見的現(xiàn)象。肝癌中p53、p15、p16、p14、RASSF1A、SYK、TIMP-3、E-cadherin、WT1、RB1啟動(dòng)子區(qū)的同時(shí)甲基化可能作為惡性腫瘤侵襲和進(jìn)展很重要的指標(biāo)DNA甲基化通過其特有的作用因子使基因沉默是非常復(fù)雜的，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中有著非常重要的，但目前關(guān)于DNA甲基化在肝癌中如何發(fā)生，發(fā)生在肝癌的哪個(gè)階段，并不清楚。DNA甲基化是引起肝癌的原因，還是肝癌發(fā)生中伴隨有基因甲基化的改變都需要的我們作深入的研究。

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Multi gene promotion in hepatocellular carcinoma

CHEN Yue1, ZHANG Changsong2, GUO Xianling2, WEI Lixin21People's hospital of Heyuan, Heyuan 517000, China;2The East liver surgery hospital of Second military medical university, Shanghai 200433, China

Abstract:Objective To explain the aberrant methylation of tumor suppressor genes is common hepatocellular carcinoma. Methods Extracting cryopreservation of hepatocellular carcinoma, paracancerous tissues and normal liver tissues of DNA, using sodium bisulfite has the characteristics of unmethylated cytosine to uracil without changing the methylated cytosine methylation primers were designed and the non methylated primers, and then respectively by PCR reaction. We examined the metastasis suppressor gene p15, SYK, TIMP-3, E-cadherin, RASSAF1 and tumor related genes p53, RB1, WT1, P14, p16 promoter methylation status of the promoter region in 60 liver cancer, para cancer and 6 normal liver tissues. Results The frequency of promoter methylation of ten genes in 60 HCC varied from 8% in P53 to 90% in p14. The average methylated-gene numbers were significantly different between HCC and paired non-tumor tissues (P<0.05). Conclusion There are multiple gene methylation in HCC exist, and the level of methylation of liver cancer tissue than in noncancerous tissue high.

Key words:hepatocellular carcinoma; gene; methylation

作者簡(jiǎn)介：程越，碩士，主治醫(yī)師，E-mail: chengyuextp@126.com

收稿日期：2015-09-26