LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體的構建及其在睪丸間質細胞的表達

徐文丹，代曉南，朱倩，張蓓，高超，高莉，劉嘉茵，崔毓桂

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LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體的構建及其在睪丸間質細胞的表達

徐文丹，代曉南，朱倩，張蓓，高超，高莉，劉嘉茵，崔毓桂

【摘要】目的：構建鈣視網膜蛋白（CALB2）基因超表達及小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體，觀察CALB2對睪丸間質細胞雄激素合成的調節作用。方法：合成超表達及干涉的質粒，轉入制備好的細菌感受態細胞，聚合酶鏈反應（PCR）鑒定陽性重組子后測序驗證，確認構建成功的超表達及干涉慢病毒載體。用上述慢病毒載體分別感染MLTC-1及R2C間質細胞，觀察感染效率，而后用放射免疫法檢測睪酮和孕酮的合成。結果：PCR和基因測序證實LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體構建成功，并可高效感染MLTC-1及R2C細胞。超表達CALB2后，MLTC-1細胞睪酮生成顯著增加（P＜0.001）；干涉CALB2表達后，R2C間質細胞孕酮生成顯著減少（P＜0.05）。結論：成功構建了calb2基因超表達及干涉慢病毒載體，并可體外轉染睪丸間質細胞系。初步結果表明，CALB2可促進間質細胞類固醇激素生成。

【關鍵詞】鈣結合蛋白，維生素D依賴性；慢病毒屬；睪丸；萊迪希細胞；雄激素類

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：96-100）

睪丸間質細胞合成和分泌雄激素主要受下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-gonad axis，HPG軸）調控，間質細胞膜上的黃體生成激素（LH）受體（LHR）介導垂體分泌的LH作用。越來越多的證據表明，雄激素合成還受到睪丸內的局部調節——即通過睪丸內的旁分泌及自分泌途徑調節雄激素的合成[1]，這些旁分泌及自分泌因子主要有胰島素樣生長因子1（IGF-1）、轉化生長因子（TGF）、脂聯素異構體等[2-4]。間質細胞合成雄激素的能力在成年期最強，中老年期間質細胞數量減少，同時雄激素合成能力下降，將會引起男性性欲下降、勃起障礙、骨質疏松及生育力下降等癥狀，即男性遲發型性腺功能減退癥（late onset gonad hypofunction，LOH），影響著中老年男性的生活質量[5]。研究睪丸間質細胞雄激素生成調節機制有利于理解LOH的發病機制。

鈣視網膜蛋白（Calretinin，CALB2）是鈣結合蛋白家族成員之一，分子質量為29 ku，有6個EF-手性結構域，4個結構域通過協同作用對鈣離子（Ca2+）有高親和力，1個結構域對Ca2+有低親和力，另1個對Ca2+沒有親和力[6]，其最早由Rogers在雞的視網膜中發現并命名[7]，主要在神經組織、卵巢、腎上腺表達[8-9]，主要功能為緩沖細胞質中的Ca2+以防Ca2+超載[10]，而Ca2+是細胞內重要的第二信使，可通過蛋白激酶C （PKC）或鈣調蛋白激活下游蛋白酶，參與骨骼肌/心肌收縮、神經反應沖動傳導、激素合成與應用、內分泌和免疫等，在細胞核內對細胞分化、發育、增殖、壞死和凋亡等功能也起重要作用[11-14]。研究表明，在睪丸間質細胞合成雄激素時，胞內Ca2+增多[15]；阻斷Ca2+通道后，雄激素合成減少，可見Ca2+作為第二信使調節間質細胞雄激素合成[16]。筆者所在課題組的前期研究發現，CALB2在大鼠和人類睪丸間質細胞中有表達，且在成年期表達最高[17-18]，這提示CALB2參與調節睪丸間質細胞雄激素的合成。為了進一步研究CALB2在生殖系統中的作用，本研究構建了calb2超表達和干涉的慢病毒載體，并在大鼠、小鼠間質細胞系表達，觀察其對雄激素合成的影響。

1　對象與方法

1.1研究試劑MLTC-1和R2C細胞系（美國ATCC公司），F12（1×）培養基、胎牛、馬血清（美國Gibco公司），DMEM高糖和RMPA1640（美國Hyclon公司），慢病毒載體系統質粒GV287（美國Stratagene公司），293T、大腸桿菌DH5α細胞由南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科提供，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、限制性內切酶（BamHI/AgeI）、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶（美國NEB公司），質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR產物回收試劑盒（德國QIAGEN公司），Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒（美國Invitrogen公司），Trizol（美國Gibco公司），放射免疫試劑盒（北方科技有限公司），二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、胰酶、細胞裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗鼠一抗CALB2抗體（美國Santa Cruse公司），鼠抗鼠一抗ACTIN（美國Sigma-Aldrich公司），辣根過氧化物酶標記的驢抗兔/抗鼠二抗（美國Jackson immunoresearch公司），發光試劑ECL（日本TAKARA公司）。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養應用了2種睪丸間質細胞系：小鼠MLTC-1細胞和大鼠R2C細胞，前者細胞膜上有人絨毛膜促性腺激素（hCG）受體，細胞內含有全套的睪酮合成酶，可以完成睪酮合成的全過程；后者可合成大量孕酮，甚至不經由hCG刺激，但是因為該細胞系缺乏17α-羥化酶和17，20-裂解酶，因而不能最終合成睪酮[19]。后期研究發現，小鼠MLTC-1細胞本身低水平表達CALB2，適用于超表達CALB2，用以觀察CALB2超表達后睪酮合成的變化；大鼠R2C細胞本身高水平表達CALB2，適宜干涉其CALB2表達的實驗，用于觀察CALB2干

涉后孕酮合成的變化。小鼠MLTC-1細胞用10%胎牛血清+ 90%的RMPA 1640的培養液培養于培養瓶中，為防止細菌污染添加了10%青霉素和鏈霉素；大鼠R2C細胞培養液由15%馬血清+2.5%胎牛血清+82.5 %F12（1×）組成，未添加青霉素和鏈霉素；293T細胞的培養液用10%胎牛血清+90%DMEM高糖培養，均放置于37℃，5% CO2，飽和濕度的條件下培養，每天觀察細胞生長狀況，及時更換新鮮培養液。

1.2.2 calb2超表達及干涉質粒構建及基因測序驗證超表達質粒構建——設計5′端為BamHI酶切位點，3′端為AgeI酶切位點的編碼calb2上下游引物（下劃線為酶切位點）:上游引物：5′-TAGAGGATCCCGCCACCATGGCTG-3′，下游引物：3′-CAGTGAGCCCCCCATGACCGGTAT-5′，通過聚合酶鏈反應（PCR）獲取。合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，后冷卻至室溫，通過T4 DNA連接酶將雙酶切線性化的載體和DNA片段在適當的緩沖液中進行連接反應，并于16℃連接過夜，然后連接產物進行轉化實驗。陽性克隆用于基因測序。calb2干涉質粒構建——首先合成含干擾序列的單鏈DNA oligo（5′-CCGGCAGGAAGAGCGTCATGTC CTTCTCGAGAAGGACATGACGCTCTTCCTGTTTTTG-3′和5′-AATTCAAAAACAGGAAGAGCGTCATGTCCTTCTCGAGAAGG ACATGACGCTCTTCCTG-3′），然后退火配對產生雙鏈，再通過其兩端所含酶切位點直接連入酶切后的RNA干擾（RNAi）慢病毒載體上，后續步驟與超表達相似。

1.2.3慢病毒包裝與滴度測定首先制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒，將3種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000的使用說明進行293T細胞轉染，轉染后8 h更換為完全培養基，后培養48 h，收集含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮得到高滴度的慢病毒濃縮液，最后在293T細胞中測定和標定病毒滴度。

1.2.4重組超表達及干涉CALB2慢病毒載體感染間質細胞按感染復數（MOI）值為100感染MLTC-1及R2C細胞。培養MLTC-1細胞，每孔接種1×104個細胞于12孔板，至細胞長至30%開始慢病毒轉染，聚凝胺（polybrene）終濃度為5 μL/mL，分為2組：對照組細胞培養液中加空載慢病毒，實驗組細胞培養液中加超表達LV-calb2慢病毒載體，感染96 h后熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光感染率，收集細胞，留作蛋白質印跡（Western blotting）；收集培養液，留測睪酮濃度。R2C細胞處理除添加病毒為LV-siRNA-calb2和收集培養液，留測孕酮濃度外，其余與MLTC-1組處理相同。

1.2.5 Western blotting提取細胞蛋白轉染96 h后成功的細胞使用胰酶消化后用等量培養液中和胰酶，離心去上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍后加入裂解液，混勻后放于搖床30 min，再以12 000 r/min離心20 min取上清即得到細胞蛋白，保存于-80℃。BCA測定蛋白濃度：以牛血清白蛋白（BSA）為標準蛋白，酶標儀以562 nm測定吸光度值測定蛋白濃度后配樣（50 μg）。Western blotting：配12%分離膠[3.8 mL ddH2O、4 mL 30%AA、2.6 mL HCl（pH 8.8）、100 μL 10%SDS、100 μL 10%

APS]80 V預電泳10 min后轉為100 V電泳90 min，每孔上樣50 μg。隨后轉膜250 mA 120 min。5%牛奶封閉1 h后4℃過夜孵育一抗CALB2（1∶1 000）及內參ACTIN（1∶10 000），第2天洗膜10 min共3次，孵育二抗（1∶1 000）1 h后洗膜，而后ECL顯影液檢測熒光強度，并分析蛋白條帶灰度值，進行統計學分析。

1.2.6放射免疫法測定培養液睪酮及孕酮濃度慢病毒轉染成功后，吸取細胞培養液，于-80℃保存，留作測定睪酮或孕酮。按照試劑說明書，采用放射免疫法分別測定睪酮和孕酮濃度，測定敏感度分別為＜0.02 ng/mL和＜0.2 ng/mL；睪酮和孕酮濃度測定的精密度：批內CV均＜10%，批間CV均＜15%。

1.3統計學方法重復3次實驗，應用SPSS17.0軟件進行數據分析，定量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1質粒載體基因測序經基因測序鑒定，LV-calb2和LV-siRNA-calb2的目的序列與設計序列相符，LV-calb2和LV-siRNA-calb2載體構建成功，見圖1（見后插一）。

2.2慢病毒滴度測定經梯度稀釋法測定超表達LV-calb2滴度為2×108TU/mL，干涉LV-siRNA-calb2滴度為4×108TU/mL。

2.3慢病毒感染細胞效率LV-calb2慢病毒感染MLTC-1細胞96 h后，較對照組CALB2表達上調3倍以上（P＜0.001），對照組MLTC-1細胞基本不表達CALB2。LV-siRNA-calb2感染R2C細胞96 h后，較對照組CALB2表達顯著下降（P＜0.05），見圖2（見后插一）。2.4慢病毒載體感染間質細胞后激素生成MLTC-1細胞轉染LV-calb296h后，培養液中睪酮水平顯著升高（P＜0.001）。而R2C細胞轉染LV-siRNA-calb2 96 h后，孕酮生成顯著減少（P＜0.05），見圖3。

3　討論

本研究使用的慢病毒載體是以人免疫缺陷病毒（HIV）為基礎構建的基因治療載體，可感染分裂細胞和非分裂細胞，幾乎可用于所有的細胞包括原代細胞轉染，轉染效率較高[20]。慢病毒攜帶的基因為RNA，可整合至宿主細胞，并可以在體內較長期表達，安全性高，而免疫反應小[20]。與腺病毒載體相同，慢病毒載體也可以帶有綠色熒光標記，用于觀察細胞轉染率[20]。但腺病毒載體只能瞬時表達目的蛋白，不能穩定表達，且細胞毒性大[21-22]。本課題組曾構建calb2超表達及干涉腺病毒載體[23-24]，其中MLTC-1細胞可高效轉染，但R2C不能被轉染，隨后嘗試過電轉、脂質體等方法均未成功。因而，本課題組參照國內外文獻[25-26]成功構建了慢病毒載體LV-calb2和LV-siRNA-calb2，并經鑒定和細胞轉染測試LV-calb2和LV-siRNA-calb2感染的MLTC-1和R2C細胞，發現慢病毒載體能夠成功轉染這2種睪丸間質細胞。

圖3 MLTC-1和R2C分別轉染LV-calb2和LV-siRNA-calb2后激素生成的水平

CALB2屬于鈣結合蛋白家族，與成員鈣調蛋白和小清蛋白相似，是細胞內Ca2+緩沖劑[27]，還可以作為Ca2+感受器發揮作用，與Ca2+通道互相作用[28]，促進細胞外Ca2+內流。CALB2在神經系統中發揮重要作用，可以調節神經元的神經遞質釋放從而控制神經元的可塑性[29]；還可以與亨廷頓蛋白相互作用，減少神經細胞的凋亡。近年發現，在卵巢和睪丸中也存在CALB2的表達，且成年期睪丸中的表達水平最高；睪丸中CALB2表達定位于間質細胞，因此其參與了間質細胞合成雄激素這一主要功能[31]。間質細胞分泌睪酮，這一功能主要受HPG軸調節[32]，垂體分泌的LH促進間質細胞合成并分泌睪酮[33]。LH結合間質細胞膜LHR，激活腺苷酸環化酶，將三磷酸腺苷轉化為環磷酸腺苷（cAMP）進而激活蛋白激酶A（PKA），PKA可激活下游的類固醇激素合成酶的轉錄因子或直接激活類固醇激素合成酶，促進睪酮合成[34]。除上述經典的LH-PKA通路外，LH也可激活磷脂酶C （PLC）將磷酸肌醇裂解為三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油，IP3可激活胞內鈣通道，從而胞質Ca2+增多，激活下游PKC或鈣調蛋白通路，發揮和PKA類似作用。可見Ca2+也作為LH下游的第二信使，調節間質細胞雄激素的合成[35]，其作用機制可能通過Ca2+激活鈣調蛋白進而促進類固醇激素急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）表達增加雄激素的合成[36]。CALB2可表達于間質細胞的細胞質中并作為Ca2+緩沖劑，可能作為一自分泌因子調控睪酮的生成[37]。本研究發現，小鼠間質細胞高表達CALB2可促進雄激素的合成；大鼠間質細胞降低CALB2表達則抑制雄激素前體（孕酮）的合成，綜上，推測CALB2可能通過作用于Ca2+進而正向調節間質細胞的合成。

本研究成功構建慢病毒載體LV-calb2和LV-siRNA-calb2，可高效感染睪丸間質細胞，并且也證實了CALB2促進睪丸間質細胞類固醇激素生成，為下一步研究CALB2在間質細胞雄激素合成中的作用機制奠定了基礎。

參考文獻

[1] Svechnikov K，Landreh L，Weisser J，et al. Origin，development and regulation of human Leydig cells [J]. Horm Res Paediatr，2010，73（2）：93-101.

[2] Yoon MJ，Roser JF. A synergistic effect of insulin -like growth factor (IGF -I) on equine luteinizing hormone (eLH) -induced testosterone production from cultured Leydig cells of horses [J]. Anim Reprod Sci，2011，126（3/4）：195-199.

[3] Manna PR，Chandrala SP，Jo Y，et al. cAMP -independent signaling regulates steroidogenesis in mouse Leydig cells in the absenceofStARphosphorylation[J].JMol Endocrinol，2006，37（1）：81-95.

[4] Otani M，Kogo M，Furukawa S，et al. The adiponectin paralog C1q/ TNF-related protein 3 (CTRP3) stimulates testosterone production through the cAMP/PKA signaling pathway [J].Cytokine，2012，58 （2）：238-244.

[5] Huhtaniemi I，Forti G. Male late -onset hypogonadism: pathogenesis, diagnosis and treatment [J]. Nat Rev Urol，2011，8 （6）：335-344.

[6] Schwaller B. Calretinin: from a "simple" Ca (2 + ) buffer to a multifunctional protein implicated in many biological processes [J]. Front Neuroana，2014，8：3.

[7] Hack NJ，Wride MC，Charters KM，et al. Developmental changes in the subcellular localization of calretinin [J]. J Neurosci，2000，20 （7）：RC67.

[8] Afework M，Burnstock G. Calretinin immunoreactivity in adrenal glands of developing, adult and ageing Sprague-Dawley rats [J]. Int J Dev Neurosci，1995，13（6）：515-521.

[9] Barinka F，Druga R. Calretinin expression in the mammalian neocortex: a review [J]. Physiol Res，2010，59（5）：665-677.

[10] Schwaller B. The use of transgenic mouse models to reveal the functions of Ca2 +buffer proteins in excitable cells [J]. Biochim Biophys Acta，2012，1820（8）：1294-1303.

[11] Stevenson L，Allen WL，Proutski I，et al. Calbindin 2 (CALB2) regulates 5 -fluorouracil sensitivity in colorectal cancer by modulating the intrinsic apoptotic pathway [J]. PLoS One，2011，6 （5）：e20276.

[12] Ikura M，Osawa M，Ames JB. The role of calcium-binding proteins in the control of transcription: structure to function [J]. Bioessays，2002，24（7）：625-636.

[13] Berridge MJ，Bootman MD，Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（7）：517-529.

[14] Berridge MJ，Lipp P，Bootman MD. The versatility and universality of calcium signalling [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2000，1（1）：11-21.

[15] Manna PR，Pakarinen P，El-Hefnawy T，et al. Functional assessment of the calcium messenger system in cultured mouse Leydig tumor cells: regulation of human chorionic gonadotropin-induced expression of the steroidogenic acute regulatory protein[J]. Endocrinology，1999，140（4）：1739-1751.

[16] Abdou HS，Villeneuve G，Tremblay JJ. The calcium signaling pathway regulates leydig cell steroidogenesis through a transcriptional cascade involving the nuclear receptor NR4A1 and the steroidogenic acute regulatory protein[J]. Endocrinology，2013，154（1）：511-520.

[17] Liu S，Dai XN，Wang J，et al. Expression of calretinin in the testes of rats at different development stages[J]. J Reprod Med，2012，21 （S1）：70-76.

[18] Cui Y，Zhu H，Zhu Y，et al. Proteomic analysis of testis biopsies in men treated with injectable testosterone undecanoate alone or in combination with oral levonorgestrel as potential male contraceptive [J]. J Proteome Res，2008，7（9）：3984-3993.

[19] Ascoli M. Immortalized leydig cell lines as modelsfor studying leydig cell physiology[M]//Payne AH. Contemporary endocrinology：the leydig cell in health and disease. New York：Humana Press，2007：373-381.

[20] Houghton BC，Booth C，Thrasher AJ. Lentivirus technologies for modulation of the immune system[J]. Curr Opin Pharmacol，2015，24：119-127.

[21]馬曉生，姜建元，呂飛舟，等.腺病毒和慢病毒載體感染骨髓間質干細胞的比較[J].中華醫學雜志，2006，86（47）：3340-3344.

[22] Teschemacher AG，Paton JF，Kasparov S. Imaging living central neurones using viral gene transfer [J]. Adv Drug Deliver Rev，2005，57（1）：79-93.

[23]王菁，羅建，劉珊，等.小鼠Calb2基因重組腺病毒載體的構建與鑒定[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2012，31（4）：261-264.

[24]羅建，王菁，劉珊，等.小鼠CALB2基因SiRNA重組腺病毒載體的構建[G].中華醫學會第八次全國計劃生育學術會議論文匯編，2012.

[25]朱杰，劉婕，丁麗華，等. DEK基因RNAi慢病毒表達載體的構建及其功能鑒定[J].軍事醫學，2015，39（7）：499-503.

[26] Leoni G，Wasowicz MY，Chan M，et al. Ex Vivo and In Vivo Lentivirus-Mediated Transduction of Airway Epithelial Progenitor Cells [J]. Curr Gene Ther，2015，15（6）：581-590.

[27] Schwaller B. Cytosolic Ca2+buffers [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2（11）：a004051.

[28] Christel CJ，Schaer R，Wang S，et al. Calretinin regulates Ca2 +-dependent inactivation and facilitation of Ca (v)2.1 Ca2+channels through a direct interaction with the α12.1 subunit [J]. J Biol Chem，2012，287（47）：39766-39775.

[29] Rogers J，Khan M，Ellis J. Calretinin and other CaBPs in the nervous system [J]. Adv Exp Med Biol，1990，269：195-203.

[30] Dong G，Gross K，Qiao F，et al. Calretinin interacts with huntingtin andreducesmutanthuntingtin-causedcytotoxicity[J].JNeurochem，2012，123（3）：437-446.

[31]劉珊，徐文丹，代曉南，等.不同發育階段大鼠睪丸中Calretinin的表達[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2014，33（6）：410-414.

[32] Mendis -Handagama SM，Ariyaratne HB. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis [J]. Biol Reprod， 2001，65（3）：660-671.

[33] Habert R，Lejeune H，Saez JM. Origin, differentiation and regulation of fetal and adult Leydig cells [J]. Mol Cell Endocrinol，2001，179（1/2）：47-74.

[34] Chauvigné F，Verdura S，Mazón MJ，et al. Follicle -stimulating hormone and luteinizing hormone mediate the androgenic pathway in Leydig cells of an evolutionary advanced teleost [J]. Biol Reprod，2012，87（2）：35.

[35] Costa RR，Reis RI，Aguiar JF，et al. Luteinizing hormone (LH) acts through PKA and PKC to modulate T-type calcium currents and intracellular calcium transients in mice Leydig cells [J].CellCalcium，2011，49（3）：191-199.

[36] Abdou HS，Villeneuve G，Tremblay JJ. The calcium signaling pathway regulates leydig cell steroidogenesis through a transcriptional cascade involving the nuclear receptor NR4A1 and the steroidogenic acute regulatory protein [J]. Endocrinology，2013，154（1）：511-520.

[37]徐文丹，代曉南，崔毓桂.睪丸雄激素合成的調節機制及其研究進展[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2014，33（6）：428-433.

[本文編輯王昕]

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·論著·

Construction of LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 and Expression in Leydig Cells of Teste

XU Wen-dan，DAI Xiao -nan，ZHU Qian，ZHANG Bei，GAO Chao，GAO Li，LIU Jia -yin，CUI Yu -gui. Clinical Center of Reproductive Medicine，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029,China

【Abstract】Objective：To explore the effect of CALB2 on steriodogenesis in testicular Leydig cell，we firstly established LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors. Methods：Firstly，the over-expression and interference plasmids were synthysized，and the bacterial competent cells were prepared ahead. Secondly，polymerase chain reaction（PCR）and gene sequencing were administered to ensure the LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors constructed successfully. At last，the infection efficiency was tested and then the level of testosterone in MLTC-1 and the level of progesterone in R2C were measured by radioimmunaossay after MLTC-1 and R2C were infected with LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 respectively. Results：PCR and gene sequencing confirmed that LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors were established，with the capacity to infect efficiently MLTC -1 and R2C. Testosterone production was significantly increased in the MLTC -1 infected with LV-calb2（P＜0.001）, while progesterone production was significantly decreased in R2C infected with LV-siRNA-calb2（P＜0.05）. Conclusions：This study successfully constructed LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors which could infect Leydig cells with high-efficiency. The preliminary result indicated that CALB2 promoted steriodogenesis in Leydig cells.

【Keywords】Calcium-binding protein, vitamin D-dependent；Lentivirus；Testis；Leydig cells；Androgens

收稿日期：（2015-11-20）

Corresponding author：CUI Yu-gui，cuiygnj@njmu.edu.cn

通信作者：崔毓桂，E-mail：cuiygnj@njmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金（81170559，81370754，31301182）；江蘇省衛生廳項目（ZX201110）；江蘇省婦幼保健重點學科（FXK201221）

作者單位：210029南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科