利用轉錄組學和蛋白質組學技術揭示小麥抗旱分子機制的研究進展

張紅亮，王道文，張正斌

(1.中國科學院遺傳與發育生物學研究所農業資源研究中心，河北石家莊 050021； 2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049； 3.中國科學院遺傳與發育生物學研究所/植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101)

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利用轉錄組學和蛋白質組學技術揭示小麥抗旱分子機制的研究進展

張紅亮1,2，王道文3，張正斌1

(1.中國科學院遺傳與發育生物學研究所農業資源研究中心，河北石家莊 050021； 2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049； 3.中國科學院遺傳與發育生物學研究所/植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101)

干旱是影響小麥種植區域分布、產量和品質的最嚴重的非生物脅迫因素之一。隨著氣候變暖、淡水資源日益短缺，干旱對小麥的影響呈現加重趨勢。當前，轉錄組和蛋白質組技術已經成為研究小麥抗旱分子機制的常規和可靠工具，利用這兩種技術已在不同小麥品種和小麥野生近緣種中鑒定出了大量參與小麥抗旱分子調控網絡的基因和蛋白質。本文簡要介紹了近年來利用轉錄組和蛋白質組學技術獲得的對小麥響應干旱分子機制的認識，指出了存在的主要問題，并展望了未來發展趨勢，對應用已有的研究成果改良小麥抗旱性及進一步應用轉錄組和蛋白質組學技術更好地揭示小麥抗旱分子機理具有參考意義。

轉錄組；蛋白質組；小麥；抗旱機制

在過去小麥育種實踐中，通常將重點放在產量的提高和品質的改良等方面。近年來，隨著氣候變暖及淡水資源短缺日益嚴重，干旱對小麥生產的不良影響呈現加重趨勢，對我國乃至世界糧食安全造成嚴重威脅。因此，闡明小麥抗旱分子機理，培育抗旱小麥新品種，成為亟待解決的問題。在傳統的小麥抗旱遺傳改良實踐中，一般通過不同抗旱能力小麥品種間有性雜交進行抗旱性的改良。這種方式雖然對提高小麥抗旱性起到了很大的推動作用，但存在重要缺陷。一是由于種間生殖隔離的限制，不利于利用小麥近緣或遠緣種蘊含的優異基因或QTLs資源對小麥進行抗旱遺傳改良；二是通過有性雜交進行抗旱相關基因轉移易受不良基因連鎖的影響，如要擺脫不良基因連鎖的影響則必須對多世代、大規模的遺傳分離群體進行檢測；三是利用有性雜交轉移基因的成功與否一般需要依據表觀變異或生物測定來判斷，檢出效率易受環境因素的影響。上述缺陷在很大程度上限制了常規育種手段在小麥抗旱遺傳改良中的應用。

小麥抗旱性是非常復雜的數量性狀，涉及很多基因、microRNAs的調控以及激素、離子、代謝物等含量的變化[1]。植物可以感受外部環境脅迫信號(如干旱、高溫、鹽脅迫等)，對它們作出響應以避免脅迫對其自身造成傷害[2]。同時，植物對脅迫的響應是一個動態變化過程，可劃分為不同階段，即預警階段、適應階段和抵抗階段。當脅迫持續時間很長或脅迫程度很嚴重時，還會出現衰老死亡階段。脅迫因子去除后，植物會從脅迫條件下恢復并建立新的動態平衡，即恢復階段[3-5]。干旱可誘導植物發生三種存在相互作用的變化[6-9]：改變基因的表達(上調、下調、共表達)；改變蛋白質的合成、轉運與降解；改變代謝途徑，導致代謝物的變化。這些變化綜合調控植物對干旱脅迫的抗性。

隨著DNA測序和生物信息學等技術的發展，基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、表型組學等組學手段逐步被用于解析植物抗旱分子機制。這類研究的優勢在于能夠對植物的某一特定器官、組織中的全部基因表達情況或蛋白、代謝物的含量進行準確高效的鑒定，可以從整體了解特定器官或組織對干旱脅迫的響應機制，鑒定出參與干旱信號轉導的基因、蛋白、代謝物等。組學數據和傳統育種的整合還可以定位新的抗旱數量性狀位點(QTLs)，加快植物耐旱性改良進度[10-11]。本文對近年來利用轉錄組學和蛋白質組學技術對小麥響應干旱分子機制的認識進行了簡要介紹，指出了存在的主要問題，并展望了未來發展趨勢，為利用組學手段進一步揭示小麥抗旱分子機理提供參考。

1 轉錄組學技術在小麥抗旱研究中的應用

轉錄組學是指對某一器官或組織在某種特定條件(如干旱)下其全部RNA轉錄本豐度的研究，這是目前研究基因組水平變化最常用和最直接的方式。目前進行轉錄組學分析常用的方式有兩種：一是基因芯片(Gene chip)雜交，二是轉錄組測序(RNA-seq)。基因芯片，又名DNA微列陣(Microarray)，是由大量DNA或寡聚核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其基本原理是通過雜交檢測信號，可以實現基因轉錄信息的大規模檢測[12-13]。

Xue等[14]利用包含大約16 000條小麥表達序列標簽(ESTs)的基因芯片篩選高蒸騰效率和低蒸騰效率基因型雜交后代中差異表達基因，共發現93個在高、低蒸騰效率的株系間表達有差異的基因，其中五分之一顯著響應干旱脅迫；與生長相關的部分調節基因，在干旱脅迫時下調表達。此外，這些基因在高蒸騰效率的株系中表達量顯著高于低蒸騰效率株系，推測這些基因可能與高蒸騰效率株系生物量的產生有關。Mohammadi等[15]利用寡聚核苷酸芯片從一個耐干旱普通小麥品種中分析根響應水分脅迫的轉錄組變化，發現大部分受脫水誘導的基因(如編碼滲透保護劑、水溶性物質、蛋白酶、糖基轉移酶/水解酶、信號轉導組分等蛋白的基因)與先前報道的其他物種在滲透脅迫條件下表現相似；與天冬酰胺、海藻糖、寡肽轉運蛋白、離子結合蛋白、γ-氨基丁酸合成有關的基因上調表達；與谷胱甘肽、硫和部分氨基酸代謝相關的基因下調表達。此外，還發現了一個新的受脫水誘導的AP2/ERF類型轉錄因子，預測其是一個轉錄抑制子。Xue等[16]用cDNA芯片研究干旱條件下普通小麥葉片中參與碳水化合物代謝的基因表達變化情況，發現在長時間干旱脅迫處理下，參與卡爾文循環的大多數葉綠體中酶的編碼基因表達量顯著下調，但胞質和液泡中參與葡萄糖、果糖和果聚糖合成酶基因在脅迫處理的葉片中上調表達。進一步分析表明，參與碳固定、己糖和果聚糖積累的關鍵酶基因協同調控碳水化合物的代謝，這對于小麥適應干旱脅迫至關重要。Mohammadi等[17]利用包含大約17 000條寡聚核苷酸探針的芯片研究小麥品種“Opata”根響應水分脅迫的轉錄組變化，結果共鑒定出394個變化超過1.5倍的轉錄本，其中，190個轉錄本上調表達，204個下調表達。同時，發現多個編碼葡聚糖酶和類型III過氧化物酶的基因顯著響應水分脅迫。Secěnji等[18]用cDNA芯片對兩個水分利用效率不同且均經為期4周的中度水分脅迫的普通小麥品種 Plainsman V(耐旱)和 Kobomugi(旱敏感)分蘗期根部進行了轉錄組學分析，結果發現，Plainsman V有773個轉錄本上調和879個轉錄本下調，Kobomugi有448個轉錄本上調和507個轉錄本下調，其中，在兩個材料中均上調表達的轉錄本有207個，均下調表達的轉錄本有205個；差異表達基因的功能主要集中在運輸、蛋白質代謝、滲透保護物質合成、細胞壁合成等方面，氧化還原酶、過氧化物酶和細胞壁相關的基因僅在Plainsman V中差異表達，與脅迫和防御相關的基因在Kobomugi中誘導表達更加明顯。Naydenov等[19]對普通小麥中國春吸脹作用后萌發的胚胎用0.3 mol·L-1甘露醇處理3 d，研究其線粒體轉錄組的變化，共發現23個差異表達基因，其中，cob、ccmFn、MnSOD和AOX上調表達， nad6、 atp4和 atp9下調表達。

Affymetrix商用化小麥芯片(Wheat Affymetrix GeneChip@)的問世，使得以芯片為工具進行小麥干旱脅迫下轉錄組學研究更加普遍。 該芯片包含61 127個探針組，覆蓋了小麥42條染色體的55 052個轉錄本。序列信息來源于GenBank和EST數據庫。迄今為止，已經有很多用小麥基因組芯片進行小麥響應干旱脅迫轉錄組變化的研究。Li 等[20]對耐旱小麥品種洛旱2號和干旱敏感品種中國春幼苗根部經20% PEG6000處理6 h后的轉錄組變化進行分析，發現洛旱2號有1 593個轉錄本上調，2 238個轉錄本下調；中國春有1 404個轉錄本上調，1 493個轉錄本下調；在兩個品種中均上調的轉錄本有569個，均下調的有424個。對差異表達基因進行GO富集分析，發現與非生物脅迫刺激、有機酸合成、脂代謝等相關的生物學過程顯著富集。Alessio 等[21]對低水分利用效率硬粒小麥品種Ofanto和高水分利用效率硬粒小麥品種Cappelli在孕穗期停止灌溉至土壤含水量降至12.5%，對葉片進行轉錄組分析，在Ofanto葉片中鑒定出707個差異表達基因；在Cappelli中鑒定出248個差異表達基因；在兩個品種中均存在的差異表達基因有44個。進一步分析發現，干旱誘導了Ofanto中很多已知的與干旱相關的基因表達，而Cappelli能夠持續表達幾個在Ofanto中受干旱誘導表達的基因。Dante 等[22]對一個普通小麥品種和其衍生的長穗偃麥草7DL易位系在抽穗前期開始干旱處理，發現部分與根發育相關的基因在對照株系和易位系間差異表達，如側根發育負調節基因 KNAT3、 E2F和 SERK1等，這可以解釋易位系具有更強的水分脅迫適應性和更高的根、葉片生物量。Tamar 等[23]對耐旱野生二粒小麥品種Y12-3和干旱敏感品種A24-39在花序出現期停止澆水8 d，分析其旗葉轉錄組變化，在Y12-3中有3 184個轉錄本上調，1 478個轉錄本下調；在A24-39中有1 688個轉錄本上調，1 738個轉錄本下調；其中1 336個轉錄本在兩個品種中均上調，860個均下調。對差異表達基因進行GO富集分析，發現多種與調控和信號轉導相關的生物學過程顯著富集，特別是在Y12-3中。Srirama 等[24]對處于灌漿期的硬紅冬麥品種TAM111和TAM112在干旱條件下旗葉轉錄組變化進行分析，在TAM111發現2 131個差異表達基因，在TAM112中發現3 197個差異表達基因，兩個品種共有的差異表達基因數目為1 657個。進一步分析發現，兩個品種間與光合、碳水化合物代謝、激素代謝和其他脫水響應相關的轉錄本受到差異調控。Dimah 等[25]對耐旱硬質小麥品種 Cham1和干旱敏感硬質小麥品種Lahn及以兩者為親本的重組自交系RIL2219在開花期進行干旱處理，分析旗葉轉錄組變化，發現在3個材料間差異表達基因數目和表達模式各不相同，參與調控的差異表達基因數目較多。Aprile 等[26]對中國春及其缺失系5AL-10和硬質小麥品種Creso在開花期進行中度和重度干旱處理，分析其穎片和旗葉轉錄組變化，發現共有3 056個差異表達基因。與中國春相比，一些干旱響應基因在Creso和5AL-10缺失系中的表達量低甚至不表達，說明3種基因型小麥不同的基因組結構可能影響植物對脅迫的適應能力。Ergen等[27]對耐旱野生二粒小麥品種TR39477和干旱敏感野生二粒小麥品種TTD-22苗期葉片與根在干旱條件下轉錄組變化進行分析，發現共有9 587個轉錄本差異表達。依賴ABA的轉錄因子基因在耐旱材料中的誘導比在旱敏感材料更為迅速。此外還發現在普通小麥形成過程中，根組織中部分響應脫水的基因網絡可能發生了缺失。

小麥基因組龐大而復雜，缺少精細的基因組圖譜，限制了利用RNA-seq研究小麥對干旱的分子調控機制。目前，只有少數利用該技術探究小麥在干旱脅迫條件下轉錄組學變化的報道。Liu等[28]利用該技術對普通小麥品種TAM107苗期葉片在20% PEG6000干旱脅迫、40 ℃高溫熱脅迫以及二者共同脅迫分別處理1 h和6 h后的轉錄組變化情況進行了分析，結果表明，有上千個基因響應以上3種脅迫，其中部分基因受2種或3種脅迫的共同誘導；從109 786個基因中鑒定出4 375個編碼轉錄因子的基因，其中，1 328個響應脅迫處理；對以熱激轉錄因子(HSFs)和脫水響應元件結合蛋白(DREBs)為中心的調控網絡分析，發現它們同時參與3種脅迫的調控，這表明小麥對熱脅迫和干旱脅迫的響應存在交叉途徑；利用高通量RNA-seq獲得的數據，結合IWGSC數據庫中根據小麥染色體信息鑒定出的同源SNPs，實現了對來自小麥A、B、D三個亞基因組同源基因的區分與表達水平的定量分析。發現約68.4%來自A、B、D亞基因組的同源基因均參與了對干旱脅迫、熱脅迫或2種組合脅迫的響應，并且位于亞基因組上的三個同源基因受脅迫誘導后表達模式不同。這可以在一定程度解釋普通小麥比四倍體小麥具有更強適應能力及更廣泛分布范圍。為進一步驗證該結果，用特異性引物qRT-PCR方法檢測了9個受脅迫誘導的差異表達基因在缺體四體系中的表達情況，用于說明進行qRT-PCR的引物可有效區分來自A、B、D亞基因組的同源基因，qRT-PCR獲得的A、B、D亞基因組上的同源基因表達結果與RNA-seq數據相一致。

2 轉錄組學研究小麥抗旱的不足與未來研究重點

不同轉錄組學研究選取的器官、組織不同，處理方式、脅迫起始和持續時間以及脅迫程度各不相同，因此獲得的結果存在很大差異。相當多的研究使用高分子量糖類，例如由聚乙二醇(PEG6000、PEG8000)、 甘露糖(Mannose)等配成的不同濃度溶液，在室內模擬干旱脅迫。盡管這些處理均能降低植物組織水勢，但其對植物轉錄組的影響與田間自然干旱有很大不同。一項研究分別使用濾紙、甘露醇以及低水分含量土壤三種不同方式降低植物組織水勢，同時進行三個獨立的芯片雜交實驗，發現三種處理方式誘導的差異表達基因中僅有1%是共同的[29]。

以實現在最適生長環境下獲得最高產量為目的的馴化和人工選擇導致了現代栽培小麥品種遺傳多樣性減少，對環境脅迫耐受性也逐步降低[30]。而一些小麥祖先種如野生二粒小麥、粗山羊草等保留了進化適應的特性，具有很強的抗旱能力[31-34]。因此，充分挖掘、利用這些野生種質資源中的優異基因或QTLs，并通過傳統雜交育種、分子標記輔助育種、轉基因等方式導入到現代小麥品種中，將有助于提高現代小麥品種的遺傳多樣性，有效改良小麥的抗旱能力[31]。此外，與普通小麥相比，小麥祖先種倍性較低，基因組相對較小和簡單，進行轉錄組學分析也較為容易。當前運用基因芯片雜交或RNA-seq技術研究小麥野生近緣種在干旱脅迫下的轉錄組學研究較少，未來應加強運用這些手段解析野生種質資源耐干旱的分子機理，以便發現在普通小麥人工馴化和現代育種進程中丟失的耐旱基因及優異等位變異。

當前的研究利用比較轉錄組學方式居多，如比較對照組和處理組在干旱脅迫條件下轉錄組差異，耐旱性不同的兩種或多種基因型對干旱脅迫轉錄組響應的差異，來篩選和鑒定與脅迫相關的基因或者生物學過程、代謝通路等。由于小麥抗旱機制的復雜性和轉錄組學的高通量，幾乎每個研究都能篩選到成百上千的差異表達基因。但是目前對篩選出的差異表達基因進行后續功能驗證的研究很少。因此，構建基因共表達調控網絡，從眾多候選基因中選取關鍵調控基因，進行功能驗證并應用于育種實踐可能成為今后研究的重點內容。

選擇性剪切(可變剪切)是指一個mRNA前體通過不同的剪接方式(選擇不同的剪切位點組合)產生不同mRNA分子的過程。選擇性剪切和RNA加工屬于轉錄后調控的一部分，能夠影響mRNA的穩定性，改變編碼蛋白的含量、活性和穩定性。干旱脅迫可以通過改變剪切因子蛋白如富含絲氨酸/精氨酸的剪切因子或多聚嘧啶序列結合蛋白的表達和剪切模式控制其他基因的剪切[35-36]。已有證據表明RNA結合/穩定蛋白能夠提高植物的抗旱性[37]。目前，有關選擇性剪切對植物轉錄組和蛋白質組的影響以及在干旱脅迫下如何變化的研究仍處于起步階段。脯氨酸是一種重要的滲透調節劑，植物在受到干旱脅迫時會大量積累脯氨酸。脯氨酸合成的關鍵酶是Δ1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶，催化脯氨酸合成的第一步反應，該酶由 P5CS1基因編碼。 P5CS1基因mRNA前體的選擇性剪切能夠影響Δ1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶含量，有助于植物適應不同的氣候[38]。目前也發現其他一些與干旱有關的基因也存在選擇性剪切。當然，還有很多尚未發現的存在選擇性剪切的潛在基因。例如，編碼小麥脫水響應元件結合蛋白的 DREB2基因有三種轉錄本類型，其中兩種受到干旱或鹽脅迫的差異調控[39]。因此，系統研究在干旱脅迫下剪切因子的表達及其如何影響轉錄譜和最終植物的表型可能會成為今后在轉錄水平上研究小麥應對干旱脅迫的一個重要內容。

3 蛋白質組學在小麥抗旱研究中的應用

蛋白質是生命活動的主要承擔者，直接參與了干旱脅迫相關的眾多生物學過程[40]。蛋白質組指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質[41-42]。蛋白質組學本質上指的是大規模研究蛋白質的特征，包括蛋白質表達水平、翻譯后修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得在蛋白質水平上對于目標性狀整體而全面的認識。由于可變剪切、RNA編輯、蛋白翻譯后修飾的存在，許多基因可以表達出多種不同的蛋白質。對于一個物種來說，其蛋白質數目可能會多于其基因數目[41, 43]。因此，蛋白質組的復雜度要比基因組的復雜度高得多。與轉錄組學數據相比，蛋白質組數據與表型關系更為緊密[2, 44]。

普通小麥是異源六倍體，基因組大而且復雜，重復序列多。因而從蛋白質組出發研究小麥的抗旱反應機制是一個很好的入手點。在過去的20年間，隨著蛋白質分離和相對定量技術(如2D-DIGE、iTRAQ和MS/MS)的進步，高通量蛋白質組學技術被越來越多地用于揭示小麥抗旱反應的分子網絡調控機制。Hajheidari等[45]研究了普通小麥春麥品種Arvand、Kelk、Khazar和Afghai籽粒在干旱脅迫下蛋白質組的變化，結果發現，共有121個蛋白上調表達，主要包括硫氧還蛋白(Trx)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)、蛋白二硫鍵異構酶(PDI)、胚胎后期豐富蛋白(LEA)、過氧化物氧還蛋白(1-Cysperoxiredoxin)、熱激蛋白(sHSP17和HSP70)等，其中57個得到鑒定。Ford等[46]對澳大利亞小麥干旱敏感品種(S) Kukri和耐旱性品種(T) Excalibur、RAC875葉片在干旱條件下蛋白質組的變化進行了研究，結果共鑒定出1 299個蛋白，其中與活性氧代謝相關的蛋白水平上升，與光合和卡爾文循環相關蛋白水平下降。此外，該研究還發現脫水素(COR410)在耐旱基因型中上升幅度高于干旱敏感基因型。Alvarez等[47]對普通小麥品種Nesser(T)和Opata M85(S)根在干旱和ABA處理條件下蛋白質組的變化進行了研究，結果共鑒定出1 656個蛋白，其中805個ABA響應蛋白，包括LEA、蛋白磷酸酶PP2C等；HSP70、HSP90、G蛋白、V型ATP酶在耐旱基因型小麥中含量更高；β-細胞壁松弛蛋白、膜孔蛋白在干旱敏感基因型含量更高。Caruso等[48]研究了硬粒小麥品種Ofanto葉片響應干旱脅迫的蛋白質組變化，結果共鑒定出36個蛋白，上調表達的有碳酸酐酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)大亞基；下調表達的有Rubisco小亞基、ATP合成酶等。Budak等[49]對硬粒小麥品種Kiziltan(S)和野生二粒小麥系TR3947、TTD22(T) 葉片在持續9 d不澆水的條件下蛋白質組變化進行了研究，結果共鑒定出75個蛋白，其中11個候選蛋白與耐旱性相關；磷酸丙糖異構酶(TPI)、ATP合成酶CF1在耐受基因型小麥中含量更高；β-1, 3-葡聚糖酶、β-1, 4-葡聚糖酶、木葡聚糖轉移酶(XET)、甲硫氨酸合成酶在干旱敏感基因型含量更高。Kang等[50]對普通小麥Yumai 34葉片在15% PEG處理條件下蛋白質組變化進行了研究，結果發現82個差異蛋白，其中76個得到鑒定，上調的蛋白主要有14-3-3、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和GST等。Ye等[51]對普通小麥春麥品種Abbondanza(T)、Qingchun 38(S)在PEG6000處理下蛋白質組的變化進行了研究，結果共發現38個差異蛋白，其中35個得到鑒定，上調的蛋白有甘油醛-3-磷酸脫氫酶、26S蛋白酶體、V型ATP酶A等，下調蛋白有Rubisco大小亞基、TPI、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)等。Zhang等[52]對普通小麥品種旱選10號(T)、寧春47(S)苗期葉片在20% PEG6000處理48 h后蛋白質組的變化進行了研究，分別鑒定出173個(T)和251個(S)磷酸化蛋白，包括信號轉導組分(SnRK2 激酶、PP2C、細胞周期蛋白和鈣調蛋白2-2)、轉運蛋白(AQP、MSSP2和H+-ATPase)和胚胎后期豐富蛋白(WCOR719、WCOR825和WRAB17)等。Hao等[53]對普通小麥品種旱選10號(T)、中國春(S)的苗期葉片、根及根葉中間部分在20% PEG6000分別處理6、12、 24、48 h和恢復48 h后的蛋白質組變化進行了研究，在根中鑒定出122個差異表達蛋白，在葉片中鑒定出163個差異表達蛋白，在根葉中間部分鑒定出146個差異表達蛋白。其中，在根和根葉中間部分鑒定的蛋白主要與細胞防御和脫毒有關。在葉片中，3個與光合作用相關的蛋白含量呈顯著變化，它們分別是Rubisco大亞基、oxygen evolving enhancer protein 2(OEE2)和Rubisco活化酶。經干旱處理后，旱選10號的Rubisco大亞基和Rubisco活化酶表達顯著上調，而在中國春中這兩個蛋白表達下調或不能被檢測到。干旱解除后，旱選10號中Rubisco大亞基和Rubisco活化酶表達下調，而OEE2表達上調將近4倍；耐旱基因型旱選10號中與脅迫防御相關的差異表達蛋白數目遠高于干旱敏感型；6個與干旱耐性相關的熱激蛋白在干旱條件下顯著上調，旱選10號中HSP60、HSP90等磷酸化水平在干旱脅迫下上升。Peng等[54]對體細胞雜交小麥Shanrong 3及其親本面包小麥品種Jinan 177苗期葉片和根在18% PEG6000處理24 h后的蛋白質組變化進行了研究，結果分別鑒定出93個(根)和65個(葉)差異表達蛋白；Shanrong 3品種耐旱性的提升主要是由于其對滲透和離子穩態的調控能力增強，具有有效清除有毒副產物的能力和更好的恢復生長潛力。Demirevska等[55]對4個田間抗旱能力不同的冬小麥品種Katya、Sadovo、Zlatitza和Miziya在停止澆水7 d和恢復澆水3 d后的蛋白質組變化進行了研究，結果發現經7 d干旱后，水分恢復3 d不能使Rubisco大亞基含量恢復至對照水平，特別是對干旱敏感品種Miziya。Kamal等[56]觀察了普通小麥品種 Keumganag 10 d幼苗停止澆水9 d后蛋白質組的變化，結果發現9個蛋白上調表達，16個蛋白下調表達，11個蛋白不受影響。其中，Rubisco大小亞基、氯離子通道蛋白家族、H+-ATP酶上調；膜蛋白ATP合成酶b亞基和細胞色素b6-f復合體下調表達。Horvath等[57]對普通小麥春麥品種CY-45和其轉基因系T-117、 T-106-3/a、T-128苗期葉片經干旱處理后蛋白質組的變化進行了研究，結果發現受干旱誘導的蛋白分子量集中在15～27 kDa，pH值為6.5～7.5；受脅迫的轉基因株系中存在一些類抑制劑蛋白，如α-淀粉酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑CM1前體等，這可以解釋轉基因系干旱敏感表型。Jiang等[58]對普通小麥品種Kauz(T)和Janz(S)經干旱處理后蛋白質組的變化進行了研究，結果發現153個差異表達蛋白，其中122個得到鑒定，這些蛋白主要參與碳水化合物代謝、脫毒、防御和儲藏；兩個品種間一些關鍵蛋白表達模式顯著不同，如過氧化氫酶同工酶1、LEA、α-淀粉酶等。從上面的研究結果中，可以看出以下幾點。

(1) 不同蛋白質組學研究選取的小麥品種、器官、組織不同，處理方式、脅迫起始和持續時間以及脅迫程度也各不相同，導致鑒定的差異蛋白種類和數目有很大差異。

(2) 受干旱脅迫誘導的蛋白按功能主要可分為以下幾類：a.參與干旱脅迫信號轉導，如蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK2)、蛋白磷酸酶2C(PP2C)等；b.參與代謝途徑，如參與光合作用的Rubisco大小亞基和細胞色素b6-f復合體；c.具有脫毒、防御和儲藏功能的蛋白，如LEA、HSP等。

(3)耐旱性不同的基因型間差異表達蛋白數目和種類均有所差異。而蛋白種類的差異可能比數目的差異在決定抗旱能力強弱上發揮著更為重要的作用。同時，一些重要蛋白表達模式的差異也是造成基因型間耐旱性不同的重要原因。

(4) 大部分研究都是基于比較蛋白質組學方法，發現耐旱能力顯著差異的基因型之間在蛋白表達種類和水平等方面的不同，進而推測他們抗旱性差異的分子機理。

4 蛋白質組學在小麥抗旱研究中的不足與未來研究重點

(1)雖然利用蛋白質組學獲得了大量有關小麥在干旱條件下積累各種保護蛋白和調整細胞代謝的信息。然而，對于一些低表達量的調控蛋白，如參與脅迫信號轉導和基因表達調控的蛋白還知之甚少。這些蛋白在干旱脅迫初期的脅迫信號轉導過程中發揮重要作用。

(2)盡管從植物樣品中鑒定出了上千種蛋白，但針對某一特定組織、發育階段和環境條件下植物蛋白質組的完全揭示仍然是一個巨大的挑戰[59]。另外，隨著蛋白質組數據的日益增多，從眾多數據中挖掘關鍵蛋白，開發耐旱蛋白標記應用于小麥抗旱品種選育已成為一項緊迫的任務。

(3)蛋白質翻譯后修飾在調控蛋白功能方面發揮著重要作用。磷酸化和去磷酸化是一種常見的蛋白質翻譯后修飾形式，一些參與脅迫信號轉導的酶的活性受到磷酸化和去磷酸化的調控，進而啟動或關閉脅迫信號轉導通路。當前多數基于比較蛋白質組方法的研究集中在某一植物組織(或者某一特定的亞細胞組分，如細胞核、線粒體、質體)蛋白質含量的變化，而對其翻譯后修飾、蛋白之間相互作用研究較少。隨著研究逐步深入，對脅迫條件下植物蛋白質組的研究可能會逐步向翻譯后修飾方向傾斜。開展磷酸化蛋白質組、氧化還原蛋白質組、蛋白互作等研究有助于全面揭示蛋白的功能，幫助我們更好地理解植物對環境脅迫的適應和脅迫耐性的獲得。

5 蛋白質組和轉錄組的聯系與差異

按中心法則所述，基因表達的主要環節包括轉錄和蛋白質合成。理論上講，從生長條件和狀態相同的細胞、組織或器官獲得的轉錄組與蛋白質組數據之間應該具有較高的相關性。Koh等[60]對油菜在干旱脅迫下20個基因在轉錄和蛋白質水平進行比較，發現盡管有些基因的轉錄本和蛋白的表達模式不盡相同，二者之間仍存在顯著正相關。脅迫時間越長，相關性越明顯，因此在干旱脅迫條件下，大多數蛋白豐度的改變是由于基因轉錄水平的變化造成的，而翻譯后修飾豐富了蛋白的多樣性和功能。Budak等[49]對硬粒小麥品種Kiziltan和野生二粒小麥系TR39477、TTD22(T)進行干旱脅迫條件下蛋白質組學分析，同時挑選RuBisCO、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、GST和鐵氧還蛋白-NADP還原酶(FNR)四個蛋白對其mRNA用qRT-PCR定量，發現在有些品種和脅迫條件下，轉錄本的變化和蛋白水平的變化一致，但也有部分轉錄本的變化和蛋白水平的變化趨勢相反。比如，RuBisCO轉錄本在干旱脅迫處理下的三種基因型中均顯著下調，但其蛋白含量均上升。GST的mRNA水平在干旱處理的Kiziltan和TTD22基因型中上升，與其蛋白水平的上升一致。然而，在TR39477中則呈現相反的趨勢，轉錄本水平下降，蛋白水平上升。Peng等[54]對體細胞雜交小麥品種Shanrong 3及其親本面包小麥品種Jinan 177 苗期葉片和根用18% PEG6000模擬干旱脅迫進行蛋白質組學分析，同時用cDNA芯片進行轉錄組學分析，發現僅有20個(27.0%)差異表達蛋白在轉錄本與蛋白水平有相關性，但整體來看，蛋白質組和轉錄組之間的相關性并不強。

上述研究中觀察到的轉錄本與其蛋白水平不一致的原因可能包括以下兩點：1、基因的表達一般受到轉錄和翻譯兩個層面的調控，而每一個層面的調控又有多種方式，使得基因表達調控機制變得非常復雜。2、因為檢測的時間點不同，可能在蛋白達到峰值的時候mRNA已經降解或者在mRNA達到峰值的時候蛋白含量還在變化中。因此，將轉錄組數據和蛋白質組數據結合起來分析，才可能有助于更加全面和深入地了解控制植物響應干旱脅迫的分子機理。

6 研究展望

利用轉錄組學和蛋白質組學技術已在小麥中鑒定出一些響應干旱脅迫的基因和蛋白質，如參與干旱信號轉導的HSFs、DREBs、 TaWRKY16、 (〗TaWRKY17、 TaWRKY24、 TaWRKY19-C、 TaWRKY59、)〗 TaWRKY82、 TaWLIP19、 TaNAC69、 TaMYB33等調控基因；脫水素、胚胎后期豐富蛋白、水通道蛋白、熱激蛋白、抗氧化劑等起防御作用的功能蛋白。這些基因和蛋白質很多已被證實參與了小麥抗旱分子調控網絡。這些信息有助于更加全面系統地揭示小麥復雜的抗旱機理。

小麥基因組龐大而復雜，過去由于缺少必要的基因組信息，限制了利用轉錄組學、蛋白質組學手段對其干旱脅迫響應機制的研究。2013年以來，六倍體普通小麥及其二倍體祖先物種烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)和粗山羊草(Aegilopstauschii)基因組草圖的相繼發表[61-65]，為小麥遺傳學和基因組學研究提供了比較全面和準確的參考基因組序列。由于小麥抗旱機制復雜性，轉錄組學和蛋白質組學研究通常能發現成百上千差異表達基因或蛋白質。過去研究的思路是通過生物信息學手段進行GO和KEGG富集分析等，發現與脅迫相關的生物學過程、代謝通路等，這部分研究對系統認識小麥抗旱機制發揮了重要作用。同時，由于先前小麥遺傳轉化較為困難，通過轉基因方式等分子手段揭示鑒定出的某一基因或蛋白發揮抗旱功能的研究比較少。隨著小麥遺傳轉化體系的不斷優化、基因組編輯技術的興起等技術手段不斷進步，也為鑒定出的候選基因和蛋白的功能驗證提供了便利條件。同時，蛋白分離及定量技術也在不斷完善。可以預見，轉錄組學、蛋白質組學手段將在小麥抗旱研究中得到進一步應用，為全面和深入揭示小麥抗旱調控分子網絡做出重要貢獻。

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Progress and Prospects in the Research on Wheat Drought Response and Resistance Mechanisms Using Transcriptomic and Proteomic Approaches

ZHANG Hongliang1,2, WANG Daowen3, ZHANG Zhengbin1

(1.Center of Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,Shijiazhuang, Hebei 050021, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3.State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

Drought is one of the most serious abiotic stresses negatively affecting wheat distribution, yield and quality. With the exacerbation of global warming and the growing shortage of fresh water, the adverse effects of drought on wheat production are becoming more and more severe. Currently, the transcriptomic and proteomic approaches have become common and reliable tools in studying the mechanisms of wheat resistance to drought and many genes and proteins involved in the molecular regulatory networks of wheat response and resistance to drought have been identified in different wheat varieties and its wild relatives. This paper briefly reviews the main general findings in the research on the molecular mechanisms underlying wheat response and resistance to drought using transcriptomic and proteomic approaches. The limitations of current research and the tendency of such studies in the future are also discussed，which may be helpful to utilize the existed research findings for the improvement of wheat drought resistance and may aid more effective investigations of the mechanisms involved in wheat response and resistance to drought stress by using transcriptomic and proteomic approaches.

Transcriptome; Proteome; Wheat; Drought response and resistance mechanism

時間：2016-07-07

2016-03-03

2016-04-15

中國科學院戰略先導科技專項(A類)(XD080310703)

E-mail：hongliangzhang@genetics.ac.cn

張正斌(E-mail:zzb@sjziam.ac.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0878-10

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1530.016.html