牛溶血性曼氏桿菌的分離鑒定

盧受昇，孫彥偉，鄧國東，高慧敏，鐘柳艷，余希堯（廣東省動物衛生監督總所，廣東廣州510230）

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牛溶血性曼氏桿菌的分離鑒定

盧受昇，孫彥偉，鄧國東，高慧敏，鐘柳艷，余希堯
（廣東省動物衛生監督總所，廣東廣州510230）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛呼吸道疾病綜合癥（bovine respiratory disease complex，BRDC），俗稱運輸熱（shipping fever），的主要病原之一，隨著牛、羊肉價格的高啟，以及廣東省扶持草食動物發展政策的出臺，廣東省養牛業得到了較快的發展，出現了從各地引進牛的進行飼養的小高潮，各地陸續出現了由于長途運輸導致的牛呼吸道疾病綜合征疑似病例。2014年5月初，某牛場從山東購進架子牛81頭，大的體重250～300 kg，小的體重150～200 kg，購進后第3天就死亡1頭，20 d后，出現運輸綜合征典型癥狀，表現為發燒（41℃）、咳嗽、呼吸困難，膿性鼻液；流涎、拉稀，后期血糞；消瘦，關節腫。發病率60%左右，藥物治療的效果不明顯。剖檢病變為心包積液、與肺粘連，肺呈壞死性病灶，表面有多量纖維素性白色滲出物，肝、脾腫大。至兩個月就診時，先后死亡18頭。從病料中分離到了支原體和溶血性曼氏桿菌，現將曼氏桿菌診斷情況介紹如下。

1　材料與方法

1.1病料心、肝、脾、肺、腎、淋巴結，采自某牛場新購進3月齡病死黃牛。

1.2主要儀器與試劑營養瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂培養基為廣州環凱微生物科技有限公司產品，在使用時自行配制；全自動微生物鑒定系統Vitek 2 compact、GN細菌生化鑒定卡、革蘭染色液均為法國梅里埃公司產品；藥敏試紙為杭州天和微生物試劑有限公司產品；PCR預混試劑Premix Exq寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.3方法

1.3.1細菌分離無菌操作采集心、肝、脾、肺、腎和淋巴結等組織，接種于營養瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂平板培養基，37℃培養24 h。

1.3.2生化試驗將細菌的純培養物，經革蘭染色，選用梅里埃細菌生化鑒定卡GN在Vitek 2 compact全自動微生物鑒定系統中進行鑒定。

1.3.3藥敏試驗紙片法，按試劑說明書進行。

1.3.416S rRNA序列的測定引物采用細菌16S rRNA通用引物F27：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R1492：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，擴增長度約為1 500 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增采用50 μL體系，Premix EX 25 μL、上下游引物各1 μL、去離子水20 μL、菌液3 μL；反應程序為95℃30 s，53℃30 s，72℃90 s，30個循環；72℃延伸8 min。產物電泳回收后，送上海立菲生物技術有限公司進行測序。

2　結果

2.1細菌培養及染色特性從肝臟分離到一種菌落形態較一致的細菌。營養瓊脂上菌落為灰白色中等大小菌落，生長很旺盛；血液瓊脂上菌落為圓形，邊緣整齊，表面光滑，扁平隆起，淡白色的中等大小菌落，呈α溶血；麥康凱瓊脂上不生長。取純培養物進行革蘭染色，結果為革蘭陰性菌，球狀或桿狀，呈單個、成對、短鏈狀排列。菌體周邊可見莢膜影，見圖1。

圖1　革蘭染色

2.2生化鑒定結果全自動微生物鑒定系統Vitek 2 compact的GN卡的鑒定結果為Mannheimia hae?molytica（溶血性曼氏桿菌），鑒定值分別為97%。具體生化特性見表1。

表1　GN卡Vitek 2 compact全自動微生物鑒定系統生化鑒定

2.3藥敏試驗結果紙片法藥敏試驗結果為頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢他啶、氯霉素、頭孢西叮、頭孢哌酮、呋喃妥因、復方新諾明、大觀霉素、氧氟沙星、四環素、米諾環素、諾氟沙星、多粘菌素B高度敏感；頭孢唑啉、頭孢噻吩、紅霉素、克林霉素、環丙沙星、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、哌啦西林、慶大霉素、阿米卡星、克拉霉素敏感；苯唑西林、青霉素G、氨芐西林、萬古霉素耐藥。

2.4擴增結果PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1 500 bp左右的特異條帶（圖2），與預期大小相符。

圖2　PCR擴增結果M：DNA Marker DL-2 000；1、2：肝臟分離菌株

2.5序列分析測序結果已提交GenBank（收錄號為KM576848），將所得菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用BLAST進行同源性比較，結果與Mannheimia haemolytica（溶血性曼氏桿菌，序列號CP0006619.1）相似性達100%。在最靠前20個序列中，有16個為溶血性曼氏桿菌，2個為Mannheimiaglucosida（葡萄糖苷酶曼氏桿菌），1個為Mannheimia sp（曼氏桿菌屬），另1個為Pasteu?rella haemolytica（溶血性巴氏桿菌），與該菌株的相似性在95%～100%。從GenBank數據庫中選取不同種的曼氏菌參考株6株，鏈球菌2株，沙門菌、鴨疫里默菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、多殺性巴氏桿菌各1株（見表2），將其16S rRNA基因序列，用軟件MEGA 5.05進行多序列匹配排列，以Neighbor-Joining方式進行同源性比較，并繪制進化樹。結果發現，各種曼氏桿菌16S rRNA基因序列間存在一定的差異，但差異不超過3.8%，本菌與溶血性曼氏桿菌參考株關系最近，相似性均超過了99%；與其他4個種，相似性從高到低依次為葡萄糖苷酶曼氏桿菌、反芻獸曼氏桿菌、肉芽腫曼氏桿菌和多源曼氏桿菌。其次，該菌與多殺性巴氏桿菌相似性較高，差距為7%。本菌與大腸桿菌、沙門菌相似性差異為13.5%；與銅綠假單胞菌相似性差異為20.9%；與鏈球菌、鴨疫里默菌的同源性則更遠，超過33%（圖3）。

表2　參考16S rRNA基因序列來源及數據庫存取號

圖3　16S rDNA序列基因進化樹

3　討論

3.1牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）由多種病因與環境因素（如斷奶、運輸、混群、擁擠和通風不良）、宿主自身因素和病原體等多種因素相互作用形成的呼吸系統疾病。引起牛呼吸道疾病綜合征的細菌性病原主要包括：溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、昏睡嗜血桿菌和牛支原體。該病給北美和世界養牛業造成巨大的經濟損失。在美國每年因牛呼吸道疾病（而引起的犢牛死亡和勞動力與藥物治療費用高達數十億美元[1]。近年，我國華中、西南地區也有運輸引起的牛肺炎相關病例的報道[2-3]，該病是危害我國當前北繁南養肉牛飼養模式的重要疫病。除了牛支原體外，溶血性曼氏桿菌也是一種重要疫病的病原，需引起重視。

3.2曼氏桿菌原歸于巴氏桿菌屬，Angen等[4]根據DNA雜交及16S RNA序列的結果，建議新建立曼氏桿菌屬（Mannheimia），分為有7個種，其中5個種已定名，分別是肉芽腫曼氏桿菌（M.granuloma?tis）、溶血性曼氏桿菌（M.haemolytica）、葡萄糖苷酶曼氏桿菌（M.glucosidal）、反芻獸曼氏桿菌（M. ruminalis）和多源曼氏桿菌（M.varigena），其中溶血性曼氏桿菌的致病性最強，只能從反芻動物中分離。目前國內外對其的報道很多，它能夠引起牛、綿羊的肺炎，新生羔羊的急性敗血癥，給養牛業和養羊業帶來較大的經濟損失，據報道全球30%的病死牛與它有關[5]。溶血性曼氏桿菌通常作為正常菌群存在于健康反芻動物的上呼吸道，主要集中在鼻咽部和扁桃體隱窩。其中A1和A2血清型主要存在于牛、羊的上呼吸道，但在臨床正常牛中占主導地位的是A2血清型。研究結果表明，溶血性曼氏桿菌與宿主保持共生關系直到外界條件如應激或感染改變這種狀況。一旦這種共生關系被破壞，A1血清型迅速成為占主導地位的血清型，并引起支氣管肺炎。

3.3支原體肺炎的病例的防治過程中，除了考慮支原體敏感的泰樂菌素、氟苯尼考、支原凈等藥物外，還要考慮并發的溶血性曼氏桿菌等菌的用藥物。本病例中藥敏試驗顯示，頭孢類、磺胺類及四環素類抗菌藥物高度敏感。需對本病的防控減少運輸過程中的應激是關鍵，一旦發病，需盡早治療，用藥劑量和療程要足，一個療程要兩周以上。

參考文獻：

[1]韓猛立，康立超，鐘發剛，等.細菌性牛呼吸道疾病的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2013，40（5）：165-171.

[2]胡長敏，郭愛珍.牛支原體病的流行特點與防控措施[J].獸醫導刊，2011，11：41-43.

[3]冉智光，謝建華，駱璐，等.我國部分地區牛支原體肺炎和關節炎的病原體診斷[J].中國預防獸醫學報，2010，32（1）：40-43.

[4]?ystein Angen，Reinier Mutters，Dominique A.Caugant，et al . Taxonomic relationships of the [Pasteurella] haemolytica complex as evaluated by DNA- DNA hybridizations and 16s rRNA sequencing with proposal of Mannheimia haemolytica gen . nov . comb.nov.Mannheimia granulomatis comb.nov.Mannheimia glucosida spa nov . Mannheimiaruminalis spa nov . and Mannheimia varigena sp.Nova[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49：67-86.

[5]陳艷紅，顏忠，查振林，等.溶血性曼氏桿菌致病機制的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2010，37（12）：153-155.

作者簡介：盧受昇（1972-），男，高級獸醫師，博士，從事預防獸醫學研究，E-mail：ssLu2013@163.com

收稿日期：2015-04-27

中圖分類號：S855

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0054- 03