豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟混合感染的診斷

張　輝，楊　歡，高云航，楊　倩，楊　亮，尹　劍，常曉博，崔煥忠（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118）

?

豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟混合感染的診斷

張輝，楊歡，高云航，楊倩，楊亮，尹劍，常曉博，崔煥忠
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的一種疾病，且易引起免疫抑制，造成混合感染。該病于1987年在美國的北卡羅那、伊阿華、明尼蘇達(dá)等州的豬群首次暴發(fā)，1996年我國首次分離出PRRSV，PRRS給全世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失。豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一種高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率高，造成的損失大。我國很多豬場都存在這2種傳染病，而且PRRSV和CSFV常呈混合感染給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1　發(fā)病情況

2013年11月吉林公主嶺某養(yǎng)豬場仔豬與育成豬陸續(xù)發(fā)病，病豬精神不振，食欲不佳，便秘或腹瀉，糞便淡黃，呼吸困難，皮膚發(fā)紺，后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病程4～7 d，病情逐步惡化，并相繼死亡。部分母豬出現(xiàn)采食量下降，分娩母豬產(chǎn)死胎數(shù)上升。送檢5只死亡仔豬，其中哺乳仔豬2只，斷奶仔豬1只，木乃伊死胎2只。

2　臨床癥狀

病豬體溫升高至39.6℃～41.3℃之間，精神沉郁，采食減少或不食，病豬皮膚發(fā)紺，仔豬有不同程度的呼吸困難，呈腹式呼吸，頸下、腹部和后肢側(cè)皮膚出現(xiàn)淤血和水腫，部分病例皮下有出血斑，個(gè)別仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、木乃伊胎和死胎。

3　病理剖檢

對(duì)送檢死亡豬只剖檢，病死豬耳朵發(fā)紺，豬鼻發(fā)紫，全身、四肢出現(xiàn)大小不等紫黑色圓形的斑點(diǎn)，肺臟腫大，肺間隔增寬，呈間質(zhì)性肺炎（見前插彩版圖1），胸腔有大量黃色積液。全身淋巴結(jié)腫大（見前插彩版圖2），特別是肺門淋巴結(jié)。肝臟腫大，表面有灰白色壞死灶（見前插彩版圖3）。脾臟稍腫大、質(zhì)地稍硬、邊緣梗死（見前插彩版圖4）。腎腫大、表面有針尖大出血點(diǎn)，心外膜出血，心包積液，腸系膜淋巴結(jié)中大出血，腸黏膜脫落，潰瘍?；孛ぐ暧屑~扣狀潰瘍。膀胱有潰瘍、出血。木乃伊胎臍帶出血明顯，腎大量出血，肝呈黃紅色，心包積液，肺肉樣變，淋巴結(jié)腫大。

4　實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1細(xì)菌檢測(cè)無菌采集病豬的心血、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟和肺臟等組織，進(jìn)行涂片鏡檢，未見致病菌；同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h觀察，亦未見可疑菌落。

4.2RT-PCR檢測(cè)

4.2.1RNA提取無菌采集病豬的血液、肺臟、肝臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織，加入無菌生理鹽水，冰浴中勻漿5 min（無組織殘留），將勻漿液轉(zhuǎn)移至無核酸酶離心管中，-75℃反復(fù)凍融3次。按照RNA Lyzol試劑盒，購自上海依科賽生物制品有限公司，操作說明提取總RNA。

4.2.2引物設(shè)計(jì)合成PRRSV引物根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ATCC VR-2332株（GenBank：U87392.3）的ORF7基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物：5′- AAC GGC AAG CAG CAG AAG-3′，下游引物：5′-TGC GTA GGC AAA CTA AAC TC-3′。CSFV引物引用羅廷榮等設(shè)計(jì)引物[2]，上游引物：5′-GCTCCTGGTTGGTAAC-CTCGG-3′，下游引物5′-TGATGCT GTCACACAGGTGAA-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PRRSV預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為629 bp，CSFV預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為508 bp。

4.2.3cDNA合成利用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)，購自Invitrogen公司，合成cDNA，反應(yīng)體積為20 μL。將滅菌蒸餾水9 μL、總RNA 2 μL、10 mmol/ L dNTP混合物1 μL和Oligo（dT）201 μL加入到無核酸酶的微量離心管中，混合物在65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后再加入5×第一鏈合成緩沖液4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，輕輕混合后，在37℃下孵育2 min。加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL（200 U），混勻后，37℃孵育50 min。最后70℃加熱15 min終止反應(yīng)，利用反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。4.2.4 PCR反應(yīng)利用2x Taq Master Mix（購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)組成為：2×Taq Master Mix 10 μL、RNase-Free Water 8.0μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以PRRSV和CSFV標(biāo)準(zhǔn)株的cDNA為模板，陰性對(duì)照以滅菌蒸餾水為模板。PRRSV PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min；CSFV PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性50 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。4.2.5 PCR結(jié)果分別取兩個(gè)PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，采取病豬的血液、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟樣品，進(jìn)行RT-PCR均擴(kuò)增出629 bp（PRRSV）、508 bp（CSFV）大小的特異性條帶，與陽性對(duì)照相符，陰性對(duì)照則沒有出現(xiàn)目的條帶（圖5、圖6），表明所檢測(cè)病料PRRSV和CSFV陽性，結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢變化等，可診斷為PRRS與CSF混合感染。

圖5　病料組織PRRSV RT- PCR檢測(cè)電泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：陽性對(duì)照；2：血液樣品；3：肺臟組織；4：肝臟組織；5：淋巴結(jié)；6：脾臟；7：陰性對(duì)照

圖6　病料組織CSFV RT- PCR檢測(cè)電泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：陽性對(duì)照；2：血液樣品；3：淋巴結(jié)；4：脾臟；5：陰性對(duì)照

5　討論

PRRS是一種免疫缺陷病，破壞感染豬免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬免疫力下降，進(jìn)而造成混合感染，特別是PRRS和SCSF經(jīng)常混合感染，在臨床上二者感染后引起的臨床表現(xiàn)相似，給臨床診斷造成很大困難。因此早期診斷并及時(shí)了解發(fā)病狀況，對(duì)控制PRRS和SCSF的流行顯得尤其重要。

PRRSV的ORF7基因都具有高度的遺傳穩(wěn)定性，保守性極高[2]，以O(shè)RF7基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)的RT-PCR方法已廣泛用于PRRSV的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，該方法可用于血清、組織和肺泡巨噬細(xì)胞等樣品的檢驗(yàn)，檢測(cè)速度快，具有高度的敏感性和特異性，可以檢測(cè)到組織培養(yǎng)物中30個(gè)PRRSV單位，敏感性也要比病毒分離方法高10倍左右，且可以避免病毒的播散[3]。

目前針對(duì)PRRSV和CSFV的血清學(xué)檢測(cè)方法還包括血清病毒中和法（SVN）、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFN）和間接ELISA[4-5]，但這些方法不能判斷出抗體的產(chǎn)生是由病毒感染還是注射滅活疫苗引起的[6]，且檢測(cè)時(shí)間較長。本研究建立了快速檢測(cè)PRRSV和CSFV的RT-PCR方法，具有敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，為臨床治療贏得了時(shí)間。

由于試驗(yàn)條件與時(shí)間關(guān)系，本試驗(yàn)監(jiān)測(cè)結(jié)果未做對(duì)比試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅廷榮，莫揚(yáng)，吳文德，等.RT－PCR技術(shù)診斷豬瘟的應(yīng)用研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（3）：219 -222.

[2]魯韋韋，姜平，唐泰山，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因的遺傳變異分析[J].物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（11）：26-30.

[3]郎廣平，郭敏，韓盈盈，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法與疫苗研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（6）：195-197.

[4]洪猛，周碧君，王開功，等.豬繁殖與呼吸綜合征疑似病例實(shí)驗(yàn)室診斷[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（10）：122-127.

[5]朱佳毅，任曉峰.豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（1）：77-79.

[6] Janková J，Celer V.Expression and serological reactivity of Nsp7 protein of PRRS genotypeⅠvirus[J] . Research in Veterinary Science，93（2012）：1537-1542.

通訊作者：崔煥忠，E-mail：huanzhongcui@163.com

作者簡介：張輝（1973-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，E-mail：huizhang01525@163.com

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字[2015]第26號(hào)）；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20150101107JC）；吉林省科技廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（20140101028JC）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)

收稿日期：2014-08-05

中圖分類號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0068- 02