β-葡聚糖對巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白的影響*

李秀英，葉 云

（西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川瀘州646000）

β-葡聚糖對巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白的影響*

李秀英，葉 云

（西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川瀘州646000）

目的：探討β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及相關機制。方法：以RAW264.7巨噬細胞為細胞模型，MTT法檢測β-葡聚糖對巨噬細胞細胞活性的影響；油紅O染色觀察β-葡聚糖對巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein,oxLDL）的影響；Western blot檢測β-葡聚糖對巨噬細胞SR-A、CD36、c-fos、c-Jun蛋白表達的影響。采用SPSS 10.0統計軟件分析數據，并采用雙尾t檢驗進行統計學意義評估。結果：2.5～10 μg/mL β-葡聚糖對巨噬細胞細胞活性無影響；5 μg/mL β-葡聚糖顯著抑制巨噬細胞對ox LDL的攝取，從而減少巨噬細胞源性泡沫細胞的形成；與對照組比較，2.5～10 μg/mL的β-葡聚糖劑量依耐性降低巨噬細胞SR-A蛋白及細胞核蛋白c-Jun的表達（P＜0.05），但對CD36蛋白及細胞核蛋白c-fos表達無影響（P＞0.05）；與5 μg/mL β-葡聚糖處理組比較，c-Jun抑制劑SP600125進一步增強β-葡聚糖抑制細胞SR-A蛋白表達的作用（P＜0.05）。結論：β-葡聚糖可抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成，且與抑制c-Jun/SR-A通路相關。

動脈粥樣硬化；細胞模型；β-葡聚糖；巨噬細胞；泡沫細胞

動脈粥樣硬化是以動脈壁脂質聚集或炎癥發生為特征的慢性疾病，是不穩定性心絞痛、心肌梗塞的主要原因[1]。巨噬細胞源性泡沫細胞在動脈粥樣硬化的發生發展中起著重要的作用。對氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，oxLDL)無限制的攝取是巨噬細胞成為泡沫細胞的重要原因[2]。清道夫受體SR-A及CD36是巨噬細胞攝取oxLDL的主要受體[3]。大量的研究顯示，減少SR-A、CD36的表達可以抑制泡沫細胞的形成并最終延緩動脈粥樣硬化的發生發展[4]。

β-葡聚糖主要來源于新鮮的食品如燕麥、啤酒、酵母、食用菌等。研究顯示，β-葡聚糖具有降低血脂、抗過氧化、預防動脈粥樣硬化的作用[5]，但具體機制不詳細。此外，有研究表明，c-Jun、c-fos與泡沫細胞的形成相關[2]。本研究擬從SR-A、CD36、c-Jun、c-fos蛋白表達變化的角度探討β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞的影響，為β-葡聚糖抗動脈粥樣硬化作用機制的研究和臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

RAW264.7巨噬細胞（來自小鼠）由重慶醫科大學生命科學院提供；用1640培養基加10%胎牛血清置于含5%CO2，37℃的培養箱進行培養，胰酶消化傳代。培養液中加入β-葡聚糖（0，2.5，5，10 μg/mL）干預24 h，加入20 μL MTT孵育4 h后，加入DMSO 120 μL震蕩10 min，在波長570 nm處檢測吸光度A570。

1.2 油紅O染色

將RAW 264.7細胞接種于6孔板內，隨機分為對照組、oxLDL處理組 （80 μg/mL oxLDL孵育細胞24 h）、β-葡聚糖處理組 (5 μg/mL β-葡聚糖及80 μg/mL oxLDL共同孵育細胞24 h)。細胞孵育結束后，吸棄上清液，10%多聚甲醛固定30 min，PBS輕輕洗1次后，油紅O染色10 min，再用60%異丙醇洗細胞1次（孵育時間10 s），吸棄異丙醇，PBS輕輕洗1次后顯微鏡下照相。

1.3 實驗試劑

油紅O、甘油明膠、β-葡聚糖購自sigma公司；SR-A、CD36、c-Jun、c-fos、β-actin抗體購自美國Abcam公司；1640培養基、消化胰酶、胎牛血清購自Gibco公司；oxLDL購自廣州奕源生物公司。

1.4 Western blot檢測相關蛋白的表達

收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞并提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。25 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后煮沸 10 min，SDS-PAGE電泳100V恒壓2 h，濕轉500 mA恒流1.5 h，5%脫脂奶粉封膜1 h，PBST漂洗3次后分別加入一抗和β-actin 4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，37℃二抗（1∶1 000稀釋）反應1 h后進行ECL顯色。以β-actin作為內參，計算目的蛋白的表達。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 β-葡聚糖對RAW264.7巨噬細胞細胞活性的影響

不同濃度的β-葡聚糖（0、2.5、5、10 μg/mL）孵育巨噬細胞24 h后，采用MTT法檢測細胞活性，檢測所得A570值分別為3.65±0.05、3.68±0.06、3.68 ±0.061、3.69±0.069，β-葡聚糖處理組與對照組（0 μg/mL β-葡聚糖）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果如圖1所示，2.5～10 μg/mL的β-葡聚糖對RAW264.7細胞的細胞活性無影響，因此，在后續實驗中選取的β-葡聚糖濃度為2.5～10 μg/mL。

圖1 β-葡聚糖對巨噬細胞細胞活性的影響

2.2 β-葡聚糖對巨噬細胞源性的泡沫細胞形成的影響

由圖2可知，對照組細胞內聚集的脂質較少，oxLDL處理組細胞內脂質明顯增多，油紅O染色后陽性細胞數為對照組的（5±0.07）倍，與oxLDL組比較，β-葡聚糖（5 μg/mL）處理細胞后，細胞內脂質聚集減少，油紅O染色后陽性細胞減少（90±1.8）%。圖2的結果表明β-葡聚糖可以抑制巨噬細胞對oxLDL攝取，從而減少泡沫細胞的形成。

2.3 β-葡聚糖對巨噬細胞細胞膜蛋白SR-A、CD36蛋白表達的影響

如圖3所示，β-葡聚糖劑量依耐性的減少巨噬細胞SR-A蛋白的表達，不同濃度（2.5、5、10 μg/mL）的β-葡聚糖處理巨噬細胞后，SR-A蛋白表達量分別為對照組的0.6±0.02、0.56±0.04、0.3±0.031倍，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。但β-葡聚糖對CD36蛋白的表達無影響，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細胞后，CD36蛋白表達量分別為對照組的0.99±0.04、0.986±0.08、0.98± 0.07倍，β-葡聚糖處理組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明β-葡聚糖可能通過抑制SR-A蛋白表達，從而抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取。

圖2 β-葡聚糖對巨噬細胞源性的泡沫細胞形成的影響（油紅O染色×400）

圖3 β-葡聚糖對巨噬細胞CD36、SR-A蛋白表達的影響

圖4 β-葡聚糖對巨噬細胞細胞核c-fos、c-Jun蛋白量的影響

2.4 β-葡聚糖對巨噬細胞細胞核c-Jun、c-fos蛋白表達的影響

如圖4所示，β-葡聚糖劑量依耐性的減少細胞核c-Jun蛋白量，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細胞后，細胞核c-Jun蛋白量降低為對照組的0.5±0.03、0.4±0.04、0.3±0.07倍，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但對細胞核c-fos蛋白量無影響，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細胞后，細胞核c-fos蛋白量降低為對照組的0.97± 0.06、0.98±0.08、0.96±0.05倍，與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 c-Jun N端激酶抑制劑SP600125對β-葡聚糖減少巨噬細胞SR-A蛋白表達的影響

如圖5所示，c-Jun N端激酶抑制劑SP600125（10 μM）進一步增加β-葡聚糖（5 μg/mL）減少巨噬細胞SR-A蛋白表達的作用。β-葡聚糖（5 μg/mL）處理細胞后，SR-A蛋白量降低為對照組的0.56±0.04倍，兩組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05）；SP600125與β-葡聚糖共同孵育巨噬細胞后，SR-A蛋白量降低為對照組的0.24±0.05倍，與β-葡聚糖處理組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），結合圖4及圖5的實驗結果，提示β-葡聚糖可能通過抑制c-Jun/SR-A通路減少巨噬細胞對oxLDL的攝取。

圖5 SP600125對β-葡聚糖減少巨噬細胞SR-A蛋白表達的影響

3 討論

已有研究表明β-葡聚糖有降血脂、預防動脈粥樣硬化的作用[5]。但β-葡聚糖是否減少巨噬細胞內脂質的聚集及相關機制尚鮮見報道。本研究顯示，β-葡聚糖通過減少巨噬細胞清道夫受體SR-A的表達，減少了巨噬細胞攝取oxLDL，進而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。

清道夫受體介導的巨噬細胞內脂質聚集在泡沫細胞形成過程中起著重要的作用[2]。本研究結果首次證明β-葡聚糖通過減少巨噬細胞對oxLDL的攝取，從而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。此外，β-葡聚糖顯著降低巨噬細胞SR-A蛋白的表達，但是對CD36蛋白的表達無影響。清道夫受體CD36和SR-A是巨噬細胞攝取oxLDL的主要受體[3]。研究表明，與對照組比較，SR-A轉基因后促進小鼠動脈粥樣硬化的發生發展以及泡沫細胞在血管壁的聚集[6]。此外，巨噬細胞SR-A蛋白的表達受抗氧化物及細胞因子的調控，表明SR-A與動脈粥樣硬化的發生相關[7-9]。本研究表明，β-葡聚糖通過抑制巨噬細胞SR-A蛋白的表達抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取與β-葡聚糖減少巨噬細胞c-Jun蛋白表達有關。結果顯示，c-Jun N-端激酶抑制劑SP600125增加了β-葡聚糖對SR-A蛋白表達的抑制作用。由此表明，β-葡聚糖抑制泡沫細胞形成需要抑制c-Jun通路。

總之，本研究結果表明，β-葡聚糖通過降低巨噬細胞細胞核c-Jun蛋白的表達，減少清道夫受體SR-A蛋白的表達，從而減少巨噬細胞對oxLDL的攝取，最終抑制泡沫細胞的形成。該研究結果為β-葡聚糖抗動脈粥樣硬化作用的機制研究和臨床應用提供了新的實驗依據。

1.Sung HJ,Kim J,Kim Y,et al.N-acetyl cysteine suppresses the foam cell formation that is induced by oxidized low density lipoprotein via regulation of gene expression [J].Mol Biol Rep,2012,39（3）:3001-7.

2.Tsai JY,Su KH,Shyue SK,et al.EGb761 ameliorates the formation of foam cells by regulating the expression of SR-A and ABCA1:role of haem oxygenase-1[J].Cardiovasc Res,2010,88（3）:415-23.

3.Lin CY,Lee TS,Chen CC,et al.Endothelin-1 exacerbates lipid accumulation by increasing the protein degradation of the ATP-binding cassette transporter G1 in macrophages[J].J Cell Physiol,2011,226（8）:2198-205.

4.Li XY,Kong LX,Li J,et al.Kaempferol suppresses lipid accumulation in macrophages through the downregulation of cluster of differentiation 36 and the upregulation of scavenger receptor class B type I and ATP-binding cassette transporters A1 and G1[J].Int J Mol Med，2013，31（2）:331-8.

5.申瑞玲，朱瑩瑩，李林，等.燕麥β-葡聚糖調節腸道菌群與降脂減肥作用的研究進展[J].食品工業科技，2014, 35（8）：364-366.

6.Van Eck M,De Winther MP,Herijgers N,et al.Effect of human scavenger receptor class A overexpression in bone marrow-derived cells on cholesterol levels and atherosclerosis in ApoE-deficient mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20（12）:2600-6.

7.Takeda N,Manabe I,Shindo T,et al.Synthetic retinoid Am80 reduces scavenger receptor expression and atherosclerosis in mice by inhibiting IL-6[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26（5）:1177-83.

8.Napolitano M,De Pascale C,Wheeler-Jones C,et al.Effects of lycopene on the induction of foam cell formation by modified LDL[J].Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007,293（6）:E1820-7.

9.Józefowski S,Arredouani M,Sulahian T,et al.Disparate regulation and function of the class A scavenger receptors SR-AI/II and MARCO[J].J Immunol,2005,175（12）:8032-41.

（2016-01-20收稿）

Effects of茁-glucan on the uptake of oxLDL in macrophages

Li Xiuying,Ye yun
Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan Province，China

Objective：To explore the effects and the mechanisms of β-glucan on the formation of macrophage-derived foam cells.Methods：The effects of β-glucan on cell viability was examined by MTT.Oil-red O staining was used to observe the effects of β-glucan on the uptake of oxLDL，and the effects of β-glucan on SRA、CD36、c-fos、c-Jun protein expression in macrophages were investigated using Western blot.Data were analyzed using SPSS 10.0 statistical software and two-tailed t test was used for statistical significance assessment.Results:β-glucan ranged from 2.5～10 μg/mL did not affect cell viability，and at 5 μg/mL inhibited the formation of macrophage-derived foam cells via attenuating oxLDL uptake by macrophages.Compared with control group,β-glucan (2.5～10 μg/mL)treatment dose-dependently decreased the expression of SR-A and nuclear c-Jun without affecting that of CD36 and nuclear c-fos in macrophages.Compared with β-glucan at 5 μg/mL group,SP600125(c-Jun inhibitor)significantly augmented the inhibitory effects of β-glucan on SR-A expression(P＜0.05).Conclusion：β-glucan could inhibit the formation of macrophage-derived foam cells,which are possibly related to the inactivation of c-Jun/SR-A pathway.

Athrosclerosis;Cell model;β-glucan;Macrophage;Foam cells

R645

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.002

*國家青年自然科學基金（81500357）

李秀英(1987-)，女，博士。

葉 云(1963-)，男，教授。E-mail:yeyun8622@163.com