瑪咖酰胺分析方法研究進展

李紹輝，許秀麗，章飛芳，周偉娥，鄭　陽，張　元，李紅娜，張　峰，*（.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京0076；.華東理工大學藥學院，上海0037）

瑪咖酰胺分析方法研究進展

李紹輝1，2，許秀麗1，章飛芳2，周偉娥1，鄭陽1，2，張元1，李紅娜1，張峰1，*
（1.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京100176；2.華東理工大學藥學院，上海200237）

瑪咖是原產于秘魯的珍稀藥食兩用植物，含有豐富的營養物質。具有緩解疲勞、改善睡眠、改善性功能及抗氧化等生物活性。瑪咖酰胺是瑪咖中特有的活性物質，有很強的生物活性。瑪咖酰胺在瑪咖中含量很低，目前主要用溶劑回流、超聲等方法提取，高效液相色譜法及液質聯用方法進行檢測。本文對瑪咖酰胺提取分析研究進行綜述，為其進一步深入研究提供參考。

瑪咖，瑪咖酰胺，高效液相色譜法，液質聯用LI Shao-hui1，2，XU Xiu-li1，ZHANG Fei-fang2，ZHOU Wei-e1，ZHENG Yang1，2，ZHANG Yuan1，LI Hong-na1，ZHANG Feng1，*

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.）是十字花科獨行菜屬植物，原產秘魯。具有很豐富的營養價值，能夠緩解疲勞［1-3］、改善睡眠［4］、改善性功能［5-7］和抗氧化［8-10］，被稱為“秘魯人參”。瑪咖作為南美傳統的藥食兩用植物，已經在國際保健品市場上嶄露頭角。我國衛生部2002年時正式批準瑪咖進入中國并開始在云南等地種植，2011年衛生部公告第13號文件批準瑪咖粉為新資源食品。

瑪咖酰胺是瑪咖中特有的活性成分，有研究表明［11］瑪咖酰胺具有很強的生物活性，并且有改善性功能，提升生育能力［12-13］等功能。有文獻［14］用高效液相色譜法（HPLC）對干瑪咖中瑪咖酰胺含量進行測定，測得其含量僅為0.0016%～0.0123%。瑪咖酰胺作為瑪咖獨特的化學成分，關于其生物活性方面的研究卻很少，可能與瑪咖酰胺的含量低有關。目前，國內市場上有很多瑪咖產品熱銷，如瑪咖粉、瑪咖精片、瑪咖酒、瑪咖口服液等。而對瑪咖產品質量好壞的評價，沒有統一規范的標準。瑪咖酰胺作為其特有的活性成分，對其含量的準確測定將會對評價瑪咖質量好壞及質量標準的建立有重要的意義。本文就國內外文獻中有關瑪咖酰胺的研究，著重對其提取及分析檢測研究進行綜述。

1　瑪咖酰胺的形成過程

Eliana等［15］研究了新鮮瑪咖在干燥過程中瑪咖酰胺的形成過程。在鮮瑪咖干燥過程中，細胞膜和脂質釋放出大量游離脂肪酸。芐基芥子油苷在芥子酶作用下經過一系列水解反應形成芐胺。芐胺和游離脂肪酸反應形成了瑪咖酰胺。不同的游離脂肪酸和芐胺就形成了不同的瑪咖酰胺。

2　瑪咖酰胺的發現

Zheng B L等［16］用乙醇水溶液在干燥瑪咖中提取到一類結構獨特的生物堿，通過HPLC方法分離純化，再用氣質聯用（GC-MS）方法進行結構鑒定，檢出了3種瑪咖酰胺。分別是N-芐基八烷酰胺、N-芐基-16-羥基-9-羰基-（10E，12E，14E）-十八碳三烯酰胺、N-芐基-（9，16）-二羰基-（10E，12E，14E）-十八碳三烯酰胺。Muhammad I等［17］采用石油醚從干燥瑪咖中提取，并經過高分辨質譜（HRMS）、紅外光譜（IR）、核磁共振（NMR）確定結構，得到了2個新的瑪咖酰胺：N-芐基十六烷酰胺、N-芐基-5-羰基-（6E，8E）-十八碳二烯酰胺。Zhao J P等［18］報道發現了7種瑪咖酰胺，其中有5個新結構：N-芐基-9-羰基-12Z-十八碳烯酰胺、N-芐基-9-羰基-（12Z，15Z）-十八碳二烯酰胺、N-芐基-13-羰基-（9E，11E）-十八碳烯酰胺、N-芐基-15Z-二十四烷酰胺、N-（3-甲氧基芐基）-十八烷酰胺。高大方等［19］用干燥瑪咖粉末經過乙醇超聲提取，經過超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）分離分析得到3種新型結構的瑪咖酰胺：N-對羥基芐基-5-羰基-（6E，8E，10E）-十八碳三烯酰胺、N-對羥基芐基-5-羰基-（6E，8E）-十八碳二烯酰胺、N-芐基-2E-十八碳烯酰胺。Fernando E等［20］對干瑪咖用正己烷索氏提取，經過二維核磁結構鑒定，得到兩個新瑪咖酰胺：N-（4，5-二甲氧基芐基）-十六碳酰胺、N-芐基二十四碳酰胺。

瑪咖中酰胺類物質很多，主要區別在兩方面，一方面是苯環上的取代基種類和取代基的位置不同。另一方面是碳鏈的長度，碳鏈的不飽和度，不飽和鍵的位置，還有順反異構體的差別。隨著研究的深入，更多高新技術的應用，可能會有越來越多的新瑪咖酰胺被發現。

3　提取方法

3.1回流提取

回流提取是用有機溶劑通過加熱的方式對瑪咖粉末中的酰胺類物質進行提取的一種方法。當溶劑揮發后又被冷卻回到溶劑中，這樣周而復始對酰胺物質進行提取，直到提取完全。唐燕文等［21］對比了不同提取溶劑回流提取對瑪咖中酰胺類物質的提取效果。文中分別用石油醚、乙醚、不同純度的乙醇水溶液對瑪咖粉末進行提取，結果表明乙醇濃度為95%時瑪咖酰胺的提取效率最高。瑪咖酰胺是弱極性物質，所以弱極性有機溶劑能夠將其從粉末中提取出來，由于瑪咖酰胺的酰胺鍵具有成氫鍵的能力，所以與純乙醇相比，95%的乙醇提取效率更高。回流提取需要長時間加熱，在提取瑪咖酰胺時可能會因溫度過高導致提取物的不穩定。回流提取的優點是裝置簡易，節省溶劑，操作簡單，普通實驗室都很容易滿足實驗要求。然而回流提取消耗的溶劑量比較大，耗時較長，大量溶劑必然會對環境造成污染。

3.2超聲提取

超聲的原理主要是產生空化效應，熱效應和機械效應［22］。空化效應是指液體中由于超聲原因產生負壓，當負壓達到一定臨界值時，就會將液體拉斷，從而在液體中形成局部氣體或蒸汽空腔的現象。機械效應是超聲在液體內傳播過程中，傳遞的機械能使液體質點在其傳播空間內發生振動，強化了液體的擴散和傳質，加速溶解。熱效應是超聲在傳播過程中其機械能被介質吸收轉換成熱能。空化效應及伴隨的機械效應和熱效應促進瑪咖酰胺向液體中溶解，從而加快提取過程，提高效率。

Eliana等［15］在研究瑪咖酰胺形成過程時，用超聲提取，液質方法檢測其含量變化。瑪咖粉末用溶劑超聲提取，固相萃取（SPE）凈化后測定含量，避免了較大基質效應對檢測的影響。朱穎秋等［23］將瑪咖粉末用乙醇超聲提取，提取液用HPLC方法測定瑪咖酰胺的含量。由于雜質的干擾，研究的3個標準品只有2個其相鄰色譜峰分離度達到要求，另一個色譜峰不符合要求無法進行含量計算。

超聲的優點是加速提取過程，提高效率，節省溶劑和時間，操作簡單。但會對瑪咖細胞造成破壞使更多的物質被溶劑提取出來，直接檢測會造成干擾。HPLC檢測時，很多具有紫外吸收的成分會與瑪咖酰胺共流出，必須分離效果良好才能準確定量，加大了定量分析的難度。用質譜檢測，雜質會對質譜檢測產生較大的基質效應，造成結果偏高或偏低。

3.3超臨界流體萃取

超臨界流體萃取技術是利用超臨界流體從液體或固體中萃取特定成分，達到分離目標產物的一種新型分離技術［24］。超臨界流體萃取安全無毒，操作條件溫和，不易對瑪咖酰胺造成破壞［25-26］。朱穎秋等［23］對比了超臨界流體萃取、超聲提取、回流提取等提取方法的效率。結果表明超臨界流體萃取的效率和超聲提取效率相同，都低于回流提取。由于超臨界流體萃取的設備價格高昂，提取效率與超聲提取和回流提取相比并沒有明顯的優勢，所以用于瑪咖酰胺的提取并不太合適。

4　分析方法

4.1高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是在經典液相色譜法和氣相色譜法的基礎上發展起來的新型分離分析技術。具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高和分析速度快等特點，適用于復雜樣品的分離分析。文獻中對采用HPLC的方法對瑪咖酰胺進行檢測［27-30］。Megan M等［14］用合成的N-芐基十六烷酰胺作為外標物，用HPLC方法對瑪咖中的酰胺類物質進行定量分析。測得不同秘魯瑪咖樣品中酰胺類物質含量從0.0016%到0.0123%不等。朱穎秋等［23］用實驗室自制的3種瑪咖酰胺作為標準品，用HPLC方法對麗江、香格里拉、會澤和攀枝花等4個產地的瑪咖進行分析。瑪咖粉末經超聲提取后用C18色譜柱分離，208 nm作為檢測波長，用0.05%磷酸的乙腈-水溶液作為流動相梯度洗脫。結果對2種瑪咖酰胺進行了定量分析，另一種由于分離度不好，達不到定量要求。該方法平均回收率達到98%以上，線性系數r=0.9999，具有良好的精密度、穩定性和重復性。用HPLC方法對瑪咖樣品中瑪咖酰胺進行檢測，具有高效、快速等特點。但是由于瑪咖酰胺種類很多，在檢測過程中很難避免雜質對檢測的干擾，導致結果偏高，應對提取液進行凈化，使檢測解結果更為準確。

4.2液質聯用（LC-MS）

近年來，液質聯用技術得到極大的重視和發展且應用日益廣泛。液相色譜法具有對復雜基質樣品的高效分離能力，質譜法具有高選擇性、高靈敏度，可對樣品目標物進行結構分析以及定性、定量檢測［31］。LC-MS技術利用液相色譜的高效分離能力對復雜樣品進行分離，再以質譜為檢測器提供化合物的結構信息。綜合了色譜和質譜的特點形成一種優勢互補的分離鑒定技術，使樣品分離、定性和定量成為一個連續的過程。特別是液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS/MS）不僅分離能力強，選擇性好，靈敏度高，而且還可以對復雜基質樣品中的痕量成分進行確證分析，為瑪咖中酰胺類物質的準確定性定量分析提供便利。

液質聯用儀由HPLC、接口裝置及MS三大單元組成。目前常用的液相色譜與質譜聯用包括四極桿質譜和飛行時間質譜等。四級桿質譜優勢在于性能穩定、成本較低、可以同時很好地進行定性和定量分析；不足之處在于只能得到低分辨質譜數據。飛行時間質譜儀中不同質量的離子在質譜計中飛行時間的不同而達到分離。本法具有高靈敏度高選擇性，能得到高質量譜圖和化合物精確分子量。

隨著對瑪咖研究的深入，越來越多的液質聯用技術應用于瑪咖酰胺的結構發現及含量測定［32-34］。朱延財等［35］采用液相色譜-飛行時間質譜法對云南產黑色瑪咖中瑪咖酰胺含量進行分析，具有靈敏度高，分辨率高，操作簡單等特點。實驗中12種瑪咖酰胺的酰胺鍵與陽離子結合，形成穩定的［M+H］+和［M+Na］+峰，有些能形成微弱的［M+K］+峰。對3個不同品種的瑪咖樣品進行定量，結果表明云南黑色瑪咖中酰胺含量最高。高大方等［18］采UPLC-MS/MS對云南產瑪咖進行成分分析鑒定，發現了6種首次報道的瑪咖酰胺類成分。UPLC-MS/MS提供更豐富的分子量信息，為瑪咖酰胺的分析鑒定提供一定的科學依據。

5　展望

瑪咖有“秘魯人參”之稱，藥食兩用，能緩解疲勞。瑪咖酰胺是瑪咖中特有的活性成分，具有緩解疲勞，提高生育能力等功效。由于瑪咖酰胺含量很低，至今研究較少，主要集中在提取分離，分析鑒定方面，現已有回流提取、超聲提取和超臨界流體萃取等提取技術應用于瑪咖酰胺的分離，高效液相色譜法和液質聯用等分析技術應用于瑪咖酰胺的分析檢測。由于含量較低，檢測方法需要更好的靈敏度，先進的液質聯用方法將起到重要的作用。由于瑪咖酰胺的烷基鏈很長，疏水作用強，所以用普通的反向色譜柱進行分析，保留時間長，檢測過程耗時。如果增大有機相比例，保留時間將有所提前，但用液質方法檢測時不利于樣品離子化，會降低方法的靈敏度。考慮到瑪咖酰胺都有酰胺鍵，可嘗試鍵合氨基的色譜柱，采用高水相的流動相洗脫，這樣既可以使保留時間提前，又有利于樣品離子化，提高液質檢測方法的靈敏度。瑪咖提取物中雜質很多，必然會對分析造成干擾，因此前處理凈化過程至關重要。固相萃取適用于復雜樣品的凈化，對瑪咖酰胺的分析可能會有較好的效果。鑒于瑪咖酰胺含量較低，分子印跡技術應用于瑪咖酰胺的富集凈化，將會為分析方法提供便利。通過分子印跡技術的富集，普通的液相檢測就能滿足分析要求，大大降低了成本。隨著研究的深入，固相萃取、分子印跡、液質聯用等技術將會發揮重要的作用，對瑪咖酰胺的研究將會更進一步。

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Research progress in analysis methods of macamides

（1.Institute of Food Safety，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China；2.School of Pharmacy，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Maca was a rare medicinal and edible plant，originating in Peru.It contains abundant nutrients.Maca has the ability to relieve fatigue，improve sleep，improve the function and antioxidant and other biological activity. Macamides were the special active substances in Maca，having strong biological activity.The content of the macamides in maca was low.At present，the method of solvent reflux，ultrasonic extraction，HPLC and liquid chromatography-mass spectrometry were used to detect it.In this paper，the extraction and analysis of macamides were reviewed，which provides a reference for its further research.

maca；macamides；HPLC；LC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0370-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.066

2015－05－04

李紹輝（1989-），男，碩士研究生，研究方向：中藥學，E-mail：shaohui_L@126.com。

張峰（1974-），男，博士，研究員，研究方向：分析化學，E-mail：fengzhang@126.com。

國家重大科學儀器設備開發專項項目（2012YQ14000806）；北京市科技計劃課題（Z141100002614020）；質檢公益性行業科研專項（201410088）；中國檢驗檢疫科學研究院基本科研業務費專項資金資助項目（2015JK008）。