消銀合劑對銀屑病小鼠模型血清Th17細胞相關因子表達的影響

李舒佳, 閔仲生, 朱曉芳, 趙　莎

(1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省中醫院, 江蘇 南京, 210029;3. 揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州, 225001)

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消銀合劑對銀屑病小鼠模型血清Th17細胞相關因子表達的影響

李舒佳1, 閔仲生2, 朱曉芳3, 趙莎3

(1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省中醫院, 江蘇 南京, 210029;3. 揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的觀察消銀合劑對銀屑病小鼠模型外周血清中的Th17細胞相關因子表達的影響。方法40只BALB/c雌性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、消銀合劑高、低劑量組和甲氨蝶呤組，每組8只。采用咪喹莫特乳膏誘導小鼠銀屑病模型，采用銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度(PASI)評分標準觀察銀屑病樣小鼠皮損的變化情況。采用ELISA方法檢測血清Th17細胞相關因子IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α的變化。結果消銀合劑組小鼠銀屑病樣皮損程度輕于模型組，PASI評分降低，血清Th17細胞相關因子表達明顯低于模型組。甲氨蝶呤組小鼠銀屑病皮損程度輕于模型組，PASI分數降低，血清Th17細胞相關因子表達明顯低于模型組。結論消銀合劑可能通過下調Th17細胞相關因子的表達來減輕銀屑病小鼠的皮膚病變。

關鍵詞:銀屑病; 銀屑病小鼠模型; 消銀合劑; Th17細胞相關因子

銀屑病是一種以鱗屑性紅斑為臨床特點的慢性復發性炎癥性皮膚病，目前多認為是免疫因素、遺傳因素、環境因素精神因素等多因素相互作用的多基因遺傳病，免疫介導是其主要發生機制。細胞因子網絡在銀屑病發病機制中的作用已成為當前研究的熱點。咪喹莫特(IMQ)為免疫激活劑，可與Toll樣受體作用致免疫激活，誘發小鼠皮膚產生銀屑病樣皮損改變[1]。本實驗以銀屑病樣小鼠模型為基礎，觀察消銀合劑對小鼠皮損變化及Th17細胞相關因子變化的影響，現報告如下。

1材料與方法

1.1動物

雌性BALB/c小鼠40只，體質量18～20 g，由揚州大學比較醫學中心提供，實驗動物使用許可證編號SYXK(蘇)2012-0029，飼養于SPF級動物室。

1.2試劑與藥品

消銀合劑(江蘇省揚州市中醫院制劑室)；咪喹莫特(四川明欣藥業有限責任公司)；凡士林乳膏(南昌白云藥業有限公司)；甲氨蝶呤(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；IL-17、IL-6、TNF-α、IL-22等ELISA試劑盒(Boster Biological Technology Co. Ltd)。

1.3方法

1.3.1實驗動物準備：BALB/c小鼠用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)經腹腔注射麻醉，刮除背部毛發，形成2 cm×3 cm暴露區域，單籠飼養按組別分別給予藥物處理。1.3.2實驗分組及給藥：將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、消銀合劑高、低劑量組、甲氨蝶呤組，每組8只。除空白組小鼠每日背部涂抹凡士林42 mg, 其余4組小鼠每日背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg。5組小鼠同時灌胃給藥?？瞻讓φ战M與模型組分別與予生理鹽水0.1 mL; 消銀合劑高劑量組予濃度為14.36 g/(kg·d)消銀合劑溶液；消銀合劑低劑量組予濃度為7.18 g/(kg·d)消銀合劑溶液；甲氨蝶呤組給予MTX 1 mg/( kg·d), 連續12 d。

1.3.3檢測變化及方法：用數碼相機每天拍照記錄，并依據PASI評分標準(0分為無; 1分為輕度; 2分為中度；3分為重度；4分為極重度)，分別對小鼠皮損處紅斑、鱗屑、浸潤增厚程度進行評分，并將三者積分相加得到總積分，繪制相應趨勢線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。連續處理小鼠12 d，摘除眼球取血收集血清，用ELISA方法檢測相關因子變化；采血后將小鼠脫頸處死，減取小鼠背部相應皮損組織，用HE染色觀察組織形態學變化。

1.4統計學處理

采用SPSS 15.0軟件進行分析，以均數±標準差表示，兩組間均數采用t檢驗，多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組小鼠背部皮損處紅斑、鱗屑、浸潤增厚及PASI積分的變化

與空白對照組相比，咪喹莫特乳膏涂抹1 d后模型組皮膚即開始出現紅斑、鱗屑，隨著藥物作用蓄積，模型組皮損紅斑顏色由淺變深，鱗屑增多增厚，皮膚浸潤明顯。第8天前后最嚴重，形成類似銀屑病樣皮損。隨后繼續外用咪喹莫特乳膏，皮損嚴重程度不再增加，呈逐漸消退趨勢。直至12 d后，僅剩少量紅斑鱗屑，皮膚增厚也有緩解；甲氨蝶呤組、消銀合劑高/低劑量組皮損與模型組相比癥狀明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑色淺，浸潤增厚較輕?？瞻讓φ战MPASI積分趨于0，其余4組PASI積分趨勢線均表現為先上升、后下降的變化，PASI積分于1～7 d逐漸上升，第8天達高峰，隨后較快降低；咪喹莫特組、低劑量消銀合劑組、高劑量消銀合劑組、甲氨蝶呤組的PASI積分依次下降。見圖1。

2.2 消銀合劑對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損動物模型組織學變化的影響

HE染色顯示：空白對照組皮膚菲薄，見2～3層形態正常的細胞；模型組小鼠表皮明顯增厚，可見角化過度伴有角化不全，棘層細胞顯著增厚，可見Munro微膿腫，真皮炎癥細胞浸潤，表現為類似銀屑病樣改變；與模型組相比，高劑量消銀合劑組及甲氨蝶呤組小鼠變化較輕，僅有輕度的角化過度，棘層細胞輕度增厚，2組無明顯差異；低劑量消銀合劑組皮膚變化程度介于甲氨蝶呤組及IMQ組。見圖2。

2.3消銀合劑對咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠血清Th17細胞相關因子表達的影響

空白對照組IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α等細胞因子水平較低；與空白對照組相比，模型組細胞因子水平明顯升高，約為空白對照組2～3倍，其中TNF-α明顯增高，約為空白對照組的8～9倍；高劑量消銀合劑組及甲氨蝶呤組細胞因子水平輕度升高，部分接近空白對照組，高劑量消銀合劑組細胞因子水平與甲氨蝶呤組接近；低劑量消銀合劑組細胞因子水平介于高劑量消銀合劑組及模型組。見表1。

與空白組比較, *P<0.05; 與模型組比較, △P<0.05; 與高劑量消銀合劑組比, #P<0.05。

3討論

銀屑病是一種以T淋巴細胞活化和浸潤為主要特征的慢性炎癥性疾病，病程長、易復發、難治愈，目前已被定義為器官特異性的自身免疫性疾病[2]。近期研究[3-4]表明，Thl7細胞在銀屑病及其他免疫介導的炎癥性疾病中發揮較大作用。

IL-17是一種促炎癥細胞因子，主要由Th17細胞產生，具有強大的募集及激活中性粒細胞能力，能誘導活化T細胞，刺激成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞產生多種促炎遞質，如IL-1、IL-6、TNF-α等，進而誘導炎癥發生[5]。TNF-α是一種在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣泛生物學活性的細胞因子，它可誘導血管內皮細胞產生炎癥介質，通過多種方式直接或間接地誘導銀屑病的病理發生[6]。此外，IL-17還與TNF-α等炎癥因子協同，放大加強其致炎效應。IL-22可通過抑制角質形成細胞的分化、誘導銀屑病樣表皮改變參與銀屑病發病[7]。IL-6能誘導Th22細胞產生 IL-22, 進而激活STAT3信號轉導通路，然后以IL-22為主、聯合TNF-α共同介導銀屑病的進程和棘皮癥發展[8]。

本研究對小鼠模型進行了0～12 d的觀察，發現咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損隨著時間的延長呈現拋物線樣的動態變化：在咪喹莫特乳膏涂抹1～2 d后小鼠皮膚即出現紅斑、鱗屑，第7～8天時紅斑、鱗屑及浸潤現象最嚴重，此后隨著咪喹莫特給藥時間延長，皮損不再加重，有減緩趨勢。從小鼠銀屑病樣皮損PASI評分趨勢圖可以看出這一動態變化過程[9-10]。由以上結果可以推測，咪喹莫特外用誘導的小鼠銀屑病樣皮損可能是一個暫時的炎癥爆發，該模型在咪喹莫特持續作用下可能發生藥物適應、耐受現象，致使皮損出現自限性傾向[11-12]。因此，可認為咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣動物模型有時間窗的限制，前8 d為疾病的發生、發展階段，可應用于銀屑病發病機制探索、藥物篩選及干預作用機制研究[13-14]。

消銀合劑由土槐飲(土茯苓、槐花、甘草)主方加減而成，土茯苓具有選擇性抑制細胞免疫反應、抗腫瘤等作用，槐花具有保持毛細血管的正常抵抗力、減少血管通透性、對抗炎癥等作用[15]。銀屑病主要病理特征為表皮增殖活躍、角化不全、炎癥細胞浸潤、血管增生等[16]。實驗發現，消銀合劑治療咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損，顏色由鮮紅或深紅轉為淡紅，皮疹變薄，鱗屑脫落減少，面積縮小，或全部消退，皮膚癥狀得以明顯緩解，PASI積分顯著降低；IL-17、TNF-α、IL-6、IL-22等Th17細胞相關因子水平顯著下降；組織形態變化趨于正常，角化不全的細胞減少；炎癥浸潤程度降低；新生血管數量減少[17]。提示消銀合劑有明顯的抗炎作用，可能與降低Th17細胞相關因子水平，進而改善T淋巴細胞在銀屑病發病中的作用有關。

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Effect of psoriasis-eliminating preparation on expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model

LI Shujia1, Min Zhongsheng2, ZHU Xiaofang3, ZHAO Sha3

(1.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu, 210029;2.JiangsuProvincialTCMHospital,Nanjing,Jiangsu, 210029;3.ClinicalMedicineCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

KEYWORDS:psoriasis; psoriasis-eliminating preparation; psoriasis mouse model; Th17-related factors

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effect of psoriasis-eliminating preparation on the expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model. MethodsA total of 40 BALB/c female mice were randomly divided into blank control group, model group, high and low dose of psoriasis-eliminating preparation group, and methotrexate group, 8 mice in each group. Psoriasis mouse model was induced by imiquimod. The severity was assessed by psoriasis area and severity index (PASI). ELISA was used to detect changes of IL-17, IL-22, IL-6 and TNF-α. ResultsDegree of psoriasis like lesions in psoriasis-eliminating preparation group was less than that in model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. Degree of psoriasis like lesions in methotrexate group was less than model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. ConclusionPsoriasis-eliminating preparation may reduce the skin lesions of psoriasis mice by down regulate expressions of Th17-related factors.

收稿日期:2015-11-24

中圖分類號:R 758.63

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)11-004-04

DOI:10.7619/jcmp.201611002