過表達及沉默細胞黏附分子1基因膀胱癌細胞株的構建

劉莉，楊永姣，陳業剛，王尚任，劉曉強，陳少峰，孫光

(1天津醫科大學第二醫院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)

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過表達及沉默細胞黏附分子1基因膀胱癌細胞株的構建

劉莉1,2，楊永姣1,2，陳業剛1,2，王尚任1,2，劉曉強1,2，陳少峰1,2，孫光1,2

(1天津醫科大學第二醫院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)

摘要：目的構建過表達及沉默細胞黏附分子1(CADM1)基因的膀胱癌細胞株。方法 培養并收集膀胱癌細胞株T24。①過表達CADM1基因T24細胞構建：將T24細胞分為1、2、3組，real-timePCR擴增CADM1基因全長，與慢病毒載體pHBLV-IRES -ZsGreen-PGK-puro進行連接(1組)，并設載體對照組(2組)和空白對照(3組)；經酶切及測序鑒定正確后在293T細胞中包裝病毒，病毒濃縮后感染T24細胞。②沉默CADM1基因T24細胞構建：將T24細胞分為A、B、C、D、E組，設計3條針對CADM1基因的干擾序列(siRNA1/2/3)分別與載體pHBLV-U6-shRNA-ZsGreen-Puro進行連接(A、B、C組)，D組與pHBLV-U6-ZsGreen-Puro進行連接，E組為空白對照；經雙酶切、PCR及測序鑒定連接載體，在293T細胞中包裝病毒，病毒濃縮后感染T24細胞。采用real-time PCR檢測T24細胞中的CADM1 mRNA，Western blotting法檢測CADM1蛋白。結果過表達和沉默CADM1基因的慢病毒載體及細胞株均正確構建。1、2、3組CADM1 mRNA相對表達量分別為4.84±0.02、1.12±0.03、1.00±0.00，CADM1蛋白相對表達量分別為4.53±0.03、1.05±0.04、1.00±0.01，1組CADM1 mRNA及蛋白相對表達量高于2、3組(P均<0.05)。A、B、C、D、E組CADM1 mRNA相對表達量分別為0.28±0.05、0.98±0.02、0.74±0.01、0.99±0.01、1.00±0.00，CADM1蛋白相對表達量分別為0.33±0.04、0.86±0.12、0.67±0.07、1.00±0.04、1.00±0.03，A組CADM1 mRNA及蛋白相對表達量低于B、C、D、E組(P均<0.05)。結論 成功構建了過表達及沉默CADM1基因的膀胱癌細胞株T24。

關鍵詞：膀胱腫瘤；膀胱癌細胞株；細胞黏附分子1；基因沉默

膀胱癌是我國最常見的泌尿系統腫瘤，膀胱癌的預后與多種因素相關[1，2]。近年來，許多腫瘤標記物相繼被發現可用于膀胱癌的預后判斷。細胞黏附分子1(CADM1)是2001年由Kuramochi等[3]在人類非小細胞肺癌(NSCLC)中發現的一種抑癌基因。大量研究顯示，CADM1在食管癌[4]、黑色素瘤[5]、肝癌[6]、卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、肺癌[9]、喉鱗癌[10]、結腸癌[11]等人類多種腫瘤組織和細胞系中呈低表達或表達缺失，且其低表達與腫瘤較早發生侵襲、轉移有關。本課題組前期研究[12]發現，膀胱尿路上皮癌組織中CADM1蛋白表達下調，其主要機制是啟動子區CpG島甲基化。為進一步研究CADM1在膀胱癌發病中的作用及機制，我們采用慢病毒載體構建穩定過表達和沉默CADM1基因的膀胱癌細胞株T24，現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗細胞人膀胱尿路上皮癌細胞株T24由天津市泌尿外科研究所饋贈。待細胞生長穩定后進行后續實驗。收集膀胱癌細胞，分別用于穩定過表達和干擾CADM1基因慢病毒載體的構建實驗。

1.2過表達CADM1基因的T24細胞的構建

1.2.1CADM1基因擴增以CADM1 cDNA為模板，進行PCR擴增。CADM1基因上游引物序列為5′-AATCTCGAGATGGCGAGTGTAGTGCTGCC-3′，下游引物序列為5′-ATAGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCT-3′。 PCR反應體系50 μL共包括10×buffer 5 μL、dNTP 5 μL、MgSO43 μL、上下游引物各1 μL、KOD Plus酶1 μL、模板DNA 0.5 μL、ddH2O 33.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，1個循環；94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35個循環；72 ℃ 10 min，1個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收。

1.2.2慢病毒載體的構建及鑒定PCR產物回收后與慢病毒載體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro用Xho Ⅰ、Not Ⅰ雙酶切。酶切完成后再次膠回收，處理好的目的片段與載體在T4連接酶16 ℃連接過夜。連接產物轉化感受態E.coli，將轉化后的感受態E.coli 100 μL涂布于含Amp抗性(100 mg/L)的LB平板培養過夜。挑取中等大小、飽滿且未與其他克隆相接觸的單克隆接種到卡那霉素選擇性(100 mg/L)LB培養基(3 mL)，置于37 ℃恒溫搖床培養過夜。質粒小提，PCR鑒定正確后，將陽性菌液送上海桑尼生物技術有限公司測序。

1.2.3慢病毒包裝將構建好的慢病毒載體與輔助質粒進行大量抽提，當濃度大于1 μg/μL、A260/A280在1.7~1.8方可用以包裝。將處于對數生長期的293T細胞接種于直徑10 cm的培養皿中，細胞融合達80%~90%時進行轉染。慢病毒包裝系統3質粒(pSPAX2、pMD2G、pHBLVTM系列載體各10 μg)共轉染293T細胞，轉染后6 h換液。分別于轉染后48、72 h分兩次收集病毒上清(其間置換新鮮培養液)，收集后濾器過濾，4 ℃下72 000 r/min離心120 min。新鮮培養液500 μL重懸濃縮病毒沉淀，置于-80 ℃冰箱或液氮保存。

1.2.4濃縮病毒感染T24細胞將細胞分為1、2、3組，鋪盤于6孔板，每孔約5×105個，1組加入pHBLV-CADM1-IRES-ZsGreen-PGK-puro，2組加入pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro，3組不做任何處理，作為空白對照，24 h后換液。48 h后，將培養液完全更換為加有嘌呤霉素(2 μg/mL)的培養液，2 d更換1次培養液，待細胞生長穩定后，即可進行細胞傳代，2代之后無需加嘌呤霉素培養，建系完成。感染3~4 d后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況。

1.3沉默CADM1基因的T24細胞的構建設計針對CADM1的三條siRNA序列，siRNA1序列為5′-CAGATGACTTATCCTCTACAA-3′；siRNA2序列為5′-CCAGACATAAAGGTACATACT-3′；siRNA3序列為5′-AGACGCAGACACAGCTATAAT-3′。將T24細胞分為A、B、C、D、E組，其中A、B、C組分別轉染搭載siRNA1、2、3的慢病毒載體(pHBLV-U6-ZsGreen-Puro)；D組僅轉染pHBLV-U6-ZsGreen-Puro，作為空載體對照；E組作為空白對照。詳細操作步驟參考“1.2”。

1.4CADM1 mRNA及蛋白檢測

1.4.1CADM1 mRNA檢測采用real-time PCR法。CADM1 mRNA上游引物序列為5′-ATGGCGAGTGTAGTGCTGC-3′，下游引物序列為5′-GATCACTGTCACGTCTTTCG-3′；內參GAPDH mRNA上游引物序列為5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物序列為5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。 PCR反應結束后進行分析，以2-ΔΔCt代表CADM1 mRNA相對表達量。

1.4.2CADM1 蛋白檢測采用Western blotting法。按照組織蛋白抽提試劑盒說明書提取蛋白，繪制標準曲線并檢測樣本蛋白濃度；制備SDS-PAGE凝膠，取20 μg蛋白經沸水煮5 min后上樣，設置電壓80 V，電泳1.5 h；將電泳分離的樣品從凝膠轉移到固相載體PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，相應一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育2 h，以GAPDH為內參；ECL化學發光試劑加于PVDF膜上反應5 min，凝膠成像分析系統下進行顯影、定影。采用Image Pro Plus5.0軟件分析目的蛋白相對表達量。

2結果

2.1過表達CADM1基因細胞株構建情況PCR擴增產物與重組質粒pHBLV-CADM1-IRES-ZsGreen-PGK-puro轉化DH5α感受態細胞后，挑取單克隆菌株進行PCR鑒定，經雙酶切后得到片段大小約為1.3 kb，說明目的基因CADM1成功插入到載體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro中。重組質粒pHBLV-CADM1-IRES-ZsGreen-PGK-puro測序結果與Genbank上公布的序列同源性為100%。病毒濃縮感染T24細胞72 h后，GFP在T24中表達，說明細胞株構建成功。1、2、3組CADM1 mRNA相對表達量分別為4.84±0.02、1.12±0.03、1.00±0.00，CADM1蛋白相對表達量分別為4.53±0.03、1.05±0.04、1.00±0.01，1組CADM1 mRNA及蛋白相對表達量高于2、3組(P均<0.05)。

2.2沉默CADM1基因細胞株構建情況重組質粒pHBLV-U6-shRNA1/2/3-ZsGreen-Puro轉化DH5α感受態細胞后，挑取單克隆菌株進行測序，測序結果與設計序列完全一致，說明siRNA1/2/3成功插入載體pHBLV-U6-shRNA-ZsGreen-Puro中。病毒濃縮感染T24細胞72 h后，GFP在細胞中表達，說明細胞株構建成功。A、B、C、D、E組CADM1 mRNA相對表達量分別為0.28±0.05、0.98±0.02、0.74±0.01、0.99±0.01、1.00±0.00，CADM1蛋白相對表達量分別為0.33±0.04、0.86±0.12、0.67±0.07、1.00±0.04、1.00±0.03，A組CADM1 mRNA及蛋白相對表達量低于B、C、D、E組(P均<0.05)。

3討論

CADM1屬于細胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，是參與細胞間相互作用的一種膜蛋白[3]，最早是Murakami等[13]在NSCLC患者分析染色體11q23.2區域時發現。CADM1可參與細胞間黏附、細胞運動、信號轉導、介導免疫監視、抑制上皮細胞向間質細胞轉變、調節細胞周期進展、誘導細胞凋亡等過程。

大量研究[10~15]顯示，CADM1在腫瘤發生發展過程中扮演重要角色。Mao等[14]構建了TSLC1重組腺病毒載體(Ad-TSLC1)并轉染至小細胞肺癌A549細胞株，發現Ad-TSLC1可明顯抑制A549細胞增殖并促使其凋亡；將轉染Ad-TSLC1的A549細胞株移植到裸鼠皮下，發現TSLC1過表達后可使腫瘤體積縮小70%~80%，且TSLC1過表達后還可激活Caspase-3活性，促使腫瘤細胞凋亡。Lu等[10]研究發現，喉癌組織中TSLC1 mRNA和蛋白表達明顯降低，并與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關；TSLC1過表達后可抑制腫瘤細胞增殖并減弱其侵襲能力。我們前期研究也發現，膀胱尿路上皮癌組織中CADM1蛋白表達降低[12]。為進一步研究CADM1在膀胱癌中的作用及機制，我們分別構建了穩定過表達和沉默CADM1基因的膀胱癌細胞株T24。

本研究使用的過表達慢病毒包裝系統含有GFP和嘌呤霉素抗性兩個標記基因。GFP有特異性高、易識別定位、不需要底物和輔助因子、不影響細胞功能等優點，目前已作為報告基因[16]和示蹤標記[17]在多領域得到應用。我們將慢病毒載體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro(Ad-GFP1)及CADM1過表達慢病毒(Ad-CADM1)分別感染T24細胞，發現GFP在T24細胞中穩定表達，且1組CADM1 mRNA及蛋白相對表達量高于2、3組，說明過表達CADM1基因的慢病毒載體成功感染T24細胞，且CADM1得到穩定表達，成功獲得Ad-CADM1-T24和Ad-GFP1-T24細胞株。

本研究中使用的沉默慢病毒包裝系統同樣為3質粒系統，組成為pSPAX2、pMD2G和pHBLV-U6-ZsGreen-Puro。將pHBLV-U6-ZsGreen-Puro(Ad-GFP2)及對應沉默載體分別感染T24細胞，結果GFP在T24細胞中穩定表達，A組CADM1 mRNA和蛋白表達量較B、C、D、E組明顯下調，成功獲得Ad-si1-T24和Ad-GFP2-T24細胞株。

穩定過表達和沉默CADM1基因的膀胱癌細胞株的成功建立，為研究CADM1對膀胱癌侵襲、轉移的影響提供了良好基礎。CADM1在膀胱癌生長、侵襲、轉移過程中的作用及機制尚需進一步研究證實。

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Establishment of bladder cancer cell line overexpressing and silencing cell adhesion molecule 1

LIULi1,YANGYongjiao,CHENYegang,WANGShangren,LIUXiaoqiang,CHENShaofeng,SUNGuang

(1TheSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China)

Abstract:Objective To establish the bladder cancer cell subline stably expressing and silencing cell adhesion molecule 1 (CADM1). MethodsWe cultured and collected the bladder cancer cell line T24. ① Establishment of T24 overexpressing CADM1. T24 cells were divided into the groups 1, 2 and 3. The full length of CADM1 was amplified by real-time PCR and was connected with pHBLV-IRES -ZsGreen-PGK-puro lentiviral vector (group 1), a vector control group (group 2) and a blank group (group 3). Virus was packaged in 293T cells after enzyme digestion and the sequencing was correct, and viruses after being concentrated were used to infect T24 cells. ②Establishment of T24 stably silencing CADM1. T24 cells were divided into the groups A, B, C, D and E. Three sequences (siRNA1/2/3) interfering CADM1 gene were designed and were connected with pHBLV-U6-shRNA-ZsGreen-Puro lentiviral vector, respectively (groups A, B and C), pHBLV-U6-ZsGreen-Puro (group D) and a blank group (group E). The connected vector was identified using double-enzyme digestion, virus was packaged in 293T cells, and virus of enrichment was used to infect T24 cells. CADM1 mRNA and protein were assessed by real-time PCR and Western blotting. ResultsThe recombinant lentiviral vectors and cell lines of expressing and silencing of CADM1 were correctly established. The relative expression levels of CADM1 mRNA in the groups 1, 2, and 3 were 4.84±0.02, 1.12±0.03, 1.00±0.00, and the relative expression levels of CADM1 protein in the groups 1, 2, and 3 were 4.53±0.03, 1.05±0.04 and 1.00±0.01, respectively. CADM1 mRNA and protein in the group 1 was enhanced effectively as compared with that of the groups 2 and 3 (all P<0.05). The relative expression levels of CADM1 mRNA in the groups A, B, C, D and E were 0.28±0.05, 0.98±0.02, 0.74±0.01, 0.99±0.01, 1.00±0.00, and the relative expression levels of CADM1 protein in the groups A, B, C, D and E were 0.33±0.04, 0.86±0.12, 0.67±0.07, 1.00±0.04 and 1.00±0.03, respectively. CADM1 mRNA and protein in the group A was decreased as compared with that of groups B, C, D and E (all P<0.05). ConclusionThe stable bladder cancer cell lines T24 overexpressing or silencing CADM1 were successfully established.

Key words:urinary bladder neoplasms; urinary bladder carcinoma cell line; cell adhesion molecule 1; gene silencing

(收稿日期：2015-11-04)

中圖分類號：R737.14

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.007

通信作者簡介：劉曉強(1971-)，男，教授，博士生導師，主任醫師，主要研究方向為泌尿系腫瘤學和男科學。E-mail： xiaoqiangliu1@163.com

作者簡介：第一劉莉(1981-)，女，主管技師，主要研究方向為泌尿系腫瘤學和男科學。E-mail： 18622208373@163.com

基金項目：天津市自然科學基金重點項目(12JCZDJC23700)。