偽狂犬病診斷方法研究進(jìn)展及其應(yīng)用情況

莫偉強(qiáng)/長(zhǎng)治市畜牧局 郭偉軍/山西隆克爾生物制藥有限公司

?

偽狂犬病診斷方法研究進(jìn)展及其應(yīng)用情況

莫偉強(qiáng)/長(zhǎng)治市畜牧局 郭偉軍/山西隆克爾生物制藥有限公司

偽狂犬病(PR),又稱(chēng)Aujeszky氏病,是由皰疹病毒亞科、水皰病毒屬的甲型皰疹病毒引起的危害多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病。新生仔豬死亡率可達(dá)100%。

偽狂犬病在1813年首次發(fā)生于美國(guó)的牛群中，1902年由匈牙利學(xué)者Aujeszk’s證明為病毒引起，1934年由Sabin和Wright確定為皰疹病毒。1947年劉永純?cè)谖覈?guó)分離到PRV。目前該病呈世界分布，我國(guó)也廣泛流行，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要的傳染病之一。目前，PRV血清型只有一種。但近年來(lái)，PRV不斷發(fā)生變化，在流行過(guò)程中有毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。至今為止的所有疫苗都只能抑制臨診癥狀的出現(xiàn)，不能控制感染和排毒。動(dòng)物一旦被感染，病毒可在動(dòng)物體內(nèi)呈長(zhǎng)期潛伏感染狀態(tài)，難以清除。有時(shí)，在受到體內(nèi)或外界因素的刺激后，病毒還可被重新激活而排毒傳播。因此,早期快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)PRV致病毒株對(duì)有效控制PRV的流行具有重要意義。

一、病原學(xué)診斷

PRV病毒的分離鑒定被認(rèn)為是檢測(cè)病原的金標(biāo)準(zhǔn)，因該方法比較耗時(shí)，而且所需材料較高，一般作為新方法建立的驗(yàn)證方法。常采用細(xì)胞培養(yǎng)方法分離病毒。采用病豬的腎臟、腦、肝、脾及扁桃體等組織，勻漿后加適宜的雙抗（青、鏈霉素）制成乳劑，離心（3 000 rpm）10 min，取上清液接種培養(yǎng)成致密單層的細(xì)胞，觀察直至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變（CPE），鏡檢觀察細(xì)胞中有無(wú)核內(nèi)包涵體。這種方法敏感性較差。

二、電鏡的病毒檢測(cè)

電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒，根據(jù)病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征，可以做出診斷。電鏡下，PRV病毒粒子為橢圓形或圓形，二十面體立體對(duì)稱(chēng)。位于細(xì)胞核內(nèi)的無(wú)囊膜的病毒粒子直徑約110～150 nm，位于胞漿內(nèi)的帶有囊膜的成熟病毒粒子直徑約為150～180 nm，囊膜外有呈放射狀排列的纖突。該方法直觀、快速，但比較復(fù)雜，一般僅限于以研究為目的的應(yīng)用。

三、血清學(xué)診斷技術(shù)

（一）傳統(tǒng)血清學(xué)試驗(yàn)

1.瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）。自從Gutekunst D E(1997)首次報(bào)道了利用微量瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)豬血清中PRV抗體以來(lái)，由于AGID技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，因此廣泛應(yīng)用于基層醫(yī)科獸研單位和大型豬場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)定性診斷以及豬群陰性無(wú)感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進(jìn)行了比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽(yáng)性符合率為94%，可以作為一種檢測(cè)偽狂犬病和抗體水平的檢測(cè)。代明娟等利用AGID技術(shù)對(duì)5個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了抗體檢測(cè)，結(jié)果分析表明豬場(chǎng)的血清陽(yáng)性率為80.0%，顯示了AGID技術(shù)的簡(jiǎn)便和快捷。

2.乳膠凝集試驗(yàn)技術(shù)（LAT）。乳膠試驗(yàn)?zāi)夹g(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有PRV感染,幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。邱德新等應(yīng)用血清中和試驗(yàn)(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價(jià)測(cè)定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合率高，特異性強(qiáng)，LAT比SNT敏感、快速、簡(jiǎn)便和實(shí)用。唐勇在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了gG—LAT和gE—LAT試驗(yàn)技術(shù)結(jié)果表明，gG—LAT特異性強(qiáng)、敏感性高,可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學(xué)陽(yáng)性豬；gE-LAT特異、敏感且重復(fù)性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。此法用時(shí)短、特異性較強(qiáng)、簡(jiǎn)便、實(shí)用，利于基層獸醫(yī)單位和規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)推廣應(yīng)用。LAT操作簡(jiǎn)單、方便、快速，且敏感性高、特異性強(qiáng)，適用于疫病監(jiān)測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽(yáng)性豬初次篩選。

3.反向間接血凝試驗(yàn)(RPHA)。程由銓等應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，建立的RPHA檢測(cè)PRV抗原,并與VI比較，發(fā)現(xiàn)RPHA不僅特異性強(qiáng)，且與VI有同等的陽(yáng)性檢出率。但RPHA試驗(yàn)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，更適合于基層使用。

4.病毒中和試驗(yàn)（NT）。作為病毒檢測(cè)的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國(guó)家診斷PR的法定方法之一。通常應(yīng)用已知病毒檢查待檢血清中的特異性抗體，該方法操作簡(jiǎn)便，可在PK15、雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行。判定標(biāo)準(zhǔn)有觀察細(xì)胞病變、免疫熒光染色等多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果往往帶有主觀因素。雖然NT有較高靈敏度，是一種常用的診斷方法。但該法操作繁瑣，工作量大，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，給臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。

（二）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ElISA）

ELISA檢測(cè)法已被廣泛應(yīng)用PRV的檢測(cè)，ELISA在PRV的早期感染、持續(xù)感染中均得到應(yīng)用，并可以同時(shí)用于特性抗原和抗體的檢測(cè)。在診斷方面，定期采血監(jiān)測(cè)正常豬群中PRV抗體的ELISA效價(jià)，當(dāng)豬群出現(xiàn)癥狀后，根據(jù)ELISA抗體升高的程度判斷是否存在感染PRV。母源抗體的存在對(duì)疫苗的免疫效果產(chǎn)生影響，常應(yīng)用ELISA檢測(cè)方法對(duì)疫苗免疫后血清中抗體的情況進(jìn)行調(diào)查。

1.間接ELISA。Mout(1978)、A fshar(1987)、蔣玉雯(1988)等分別建立了檢測(cè)偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法，因?yàn)镋LISA敏感性高，且快速、簡(jiǎn)便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。王勇等用gE鑒別ELISA試劑盒調(diào)查某豬場(chǎng)流行情況，母豬陽(yáng)性率為81%，但缺點(diǎn)是此種方法費(fèi)用昂貴，難以在基層推廣。

2.DOT-ELISA。該方法是一種以硝酸纖維素膜等固相化基質(zhì)膜為載體的ELISA,用于檢測(cè)抗體或抗原，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果判定直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)的不足。李克榮（1989）、李健強(qiáng)(1990)等分別應(yīng)用混合纖維素酯微孔濾膜作固定支持物，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的SPA建立了斑點(diǎn)-ELISA(DOT—ELISA)，該法檢測(cè)PRV抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，使ELISA方法可用肉眼觀察結(jié)果。其敏感性明顯高于SN，適合大面積血清學(xué)普查。該法不僅繼承了常規(guī)ELISA的優(yōu)點(diǎn)，而且還具有抗原用量少、節(jié)省材料、不需特殊儀器、結(jié)果便于長(zhǎng)期保存、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

3.單克隆抗體夾心ELISA。單抗夾心ELISA是將單抗的特異性與ELISA方法相結(jié)合起來(lái),使其特異性和敏感性大大提高。苗得園等(2001)建立了由單抗介導(dǎo)的檢測(cè)PRV的單抗夾心LAB一ELISA方法，結(jié)果表明，該方法不與其他常見(jiàn)病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，病毒的最低檢出含量為8.9μg/ml。檢測(cè)時(shí)最佳采樣部位是豬腦及扁桃體。對(duì)人工感染兔、自然感染豬以及臨床可疑病豬的檢出率分別為75%、75% 及72.7%。本方法將特異性單抗和生物素一親和素系統(tǒng)引入傳統(tǒng)的ELISA中，是一種具有良好特異性及較好敏感性的診斷方法。

4.雙抗夾心ELISA。雙抗體夾心E LISA是PR臨床診斷和進(jìn)出口檢疫的一種簡(jiǎn)便而可靠的方法。祁小樂(lè)等（2004）利用所制備的兔抗PRV IgG和McAb建立的單克隆抗體雙夾心法，最低病毒檢出量為200μg/ml，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、病毒分離和中和試驗(yàn)符合率較高。婁高明等利用雙抗體夾心ELISA法對(duì)人工感染兔和自然感染豬的組織臟器進(jìn)行檢測(cè)，抗體包被量為5μg/孔，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶200，結(jié)果發(fā)現(xiàn)扁桃體、腦和肺的檢出率最高，其次為心、肝、脾、腎等組織。與VI和電鏡比較，三種方法PRV的檢出率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。

（三）免疫膠體金診斷技術(shù)

膠體金免疫層析法是將免疫膠體金技術(shù)與層析分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái)建立的一種快速免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)最早用作電鏡的示蹤標(biāo)記物，并逐步應(yīng)用于傳染病檢測(cè)。白靜等在國(guó)內(nèi)首次研發(fā)的用于豬PRV gE抗體檢測(cè)的免疫層析試紙條，無(wú)需任何設(shè)備20 min內(nèi)可檢測(cè)抗體效價(jià)，該試紙條具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異性好等特點(diǎn)，非常適用于基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖戶。廖文軍等以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(SeFv)-PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為診斷抗原和膠體金標(biāo)記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶，制作檢測(cè)PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條。試紙條在室溫保存6個(gè)月，其特異性和敏感性沒(méi)有明顯變化；與美國(guó)IDEXX和法國(guó)LSI gE—ELISA抗體檢測(cè)診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，1 164份豬血清的符合率均為90.55%。制備的膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)便、敏感性和特異性較高的特點(diǎn)，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

四、病毒RNA診斷技術(shù)

（一）核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是一種分子水平的檢測(cè)技術(shù)，是利用堿基互補(bǔ)原理檢測(cè)目的核酸片段具有敏感性、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，其最重要的一環(huán)就是特異性探針標(biāo)記，目前常用的標(biāo)記物有同位素、生物素及地高辛等。Rirtle等首次使用核酸探針技術(shù)鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學(xué)的研究資料。國(guó)內(nèi)也存在利用探針檢測(cè)技術(shù)的研究，采用32P探針標(biāo)記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應(yīng)用斑點(diǎn)雜交技術(shù)，從而獲取培養(yǎng)物中的PRV存在的信息，能檢測(cè)出10 pg的PRV-DNA，并具有較高的特異性。

1.PCR。PCR技術(shù)用于PRV診斷使診斷技術(shù)提高到基因水平，該技術(shù)是上世紀(jì)80年代建立起來(lái)的一項(xiàng)體外酶促擴(kuò)增DNA新技術(shù)，可用于PRV DNA的擴(kuò)增，也適用于檢測(cè)PRV潛伏感染豬。并且能快速鑒別PR疫苗毒與野毒。該方法具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.熒光PCR。近幾年來(lái),有不少報(bào)道運(yùn)用熒光定量PCR用于傳染病的診斷,表現(xiàn)出了良好的特異性和敏感性,顯示出了較好的應(yīng)用前景。實(shí)時(shí)熒光PCR與普通PCR相比，其特異性和靈敏度都要更高。萬(wàn)超以偽狂犬病毒（PRV）保守的gE基因序列為參考，建立的一種快速定量檢測(cè)偽狂犬病毒的熒光定量PCR技術(shù)。該方法線形范圍為1.0×102～1.0×107拷貝/μL，靈敏度達(dá)102拷貝/μLDNA，比常規(guī)PCR高10倍。檢測(cè)的特異性明顯高于常規(guī)PCR，同時(shí)避免了常規(guī)PCR因電泳造成的污染。應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)66例豬組織或鼻咽拭子樣品，陽(yáng)性檢出率為63.6%（42/66）。與病毒分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR相比較結(jié)果顯示，該方法具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好和能定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，該方法可用于豬場(chǎng)PRV感染的快速定量檢測(cè)和肉類(lèi)食品進(jìn)出口檢疫。

趙緒永等建立的建立檢測(cè)豬偽狂犬病毒（PRV）多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，具有高度特異性,與其他病原無(wú)明顯交叉反應(yīng);檢測(cè)靈敏度高,可檢出1.0×101拷貝/μL的陽(yáng)性質(zhì)?；?TCID50/mL的病毒樣品。用多重Real-time PCR對(duì)42份臨床疑似病料進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)結(jié)果與單重Real-time PCR結(jié)果完全一致。

鄭敏等建立的區(qū)分豬偽狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan—MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)2.23×10拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高100倍；對(duì)30份疑似病料的TaqMan熒光定量PCR和普通PCR檢測(cè)陽(yáng)性率分別為40%和33%，兩者符合率90%。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，可適合于PRV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

（二）限制性核酸內(nèi)切酶分析

用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)病毒DNA進(jìn)行酶切，可以呈現(xiàn)不同的帶型，從而做出診斷。Lomniezi等對(duì)Bartha、Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用Bam HI、EgIll、Kpn I酶切分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在Us區(qū)有缺失。Giekens等對(duì)NIA-3等野毒株和Rartha、BUK、Ercegovac、B-KAL、MK-25五個(gè)弱毒疫苗株DNA以BamH I酶切分析也證實(shí)疫苗株在US區(qū)有缺失，導(dǎo)致酶切圖譜改變。此法可用于分子流行病學(xué)調(diào)查。

（三）環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是建立在基礎(chǔ)PCR基礎(chǔ)上的一種新型的核酸檢測(cè)的方法，具有簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。張莉等通過(guò)對(duì)偽狂犬病毒gE基因保守區(qū)域引物設(shè)計(jì)建立的RT-LAMP方法，最低檢測(cè)量可達(dá)到100個(gè)拷貝質(zhì)粒，敏感性比常規(guī)PCR方法高10倍。張侃等通過(guò)對(duì)PRV高度保守基因gB引物設(shè)計(jì)建立的RT-LAMP對(duì)PRV的檢測(cè)的敏感性比PCR方法高100倍，最低能夠檢測(cè)10個(gè)拷貝的目的基因。王樹(shù)芬等利用新的熒光染料羅丹明B衍生物作指示劑建立的可視化LAMP檢測(cè)PRV的方法，在63℃下恒溫反應(yīng)40 min即可得到肉眼可視的結(jié)果，可視化LAMP結(jié)果與電泳結(jié)果一致。該方法可以快速、直觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)PRV,在診斷動(dòng)物疾病上有廣闊的應(yīng)用前景，適合在基層養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用。

四、小結(jié)

目前PR病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究在廣度和深度上已有了較大進(jìn)展，但各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，每一種方法都難完全做到快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用。因此對(duì)PRV感染的診斷必須建立在臨床初步診斷的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷手段，快速確定病原，然后根據(jù)判定結(jié)果，制定相對(duì)應(yīng)的免疫程序，達(dá)到快速防治PRV感染的目的。建立和完善用于我國(guó)的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國(guó)廣大獸醫(yī)科研工作者面臨的重大課題之一。

參考文獻(xiàn)（略）