紫杉醇、多西紫杉醇對大鼠肝細胞株BRL-3A細胞縫隙連接功能的影響

湯南,萬潔,陳博,張媛,陳鴻鵬

(1廣東醫科大學藥學院，廣東東莞 523808； 2廣東醫科大學基礎學院；3暨南大學附屬第一醫院；4廣東醫科大學信息工程學院)

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·基礎研究·

紫杉醇、多西紫杉醇對大鼠肝細胞株BRL-3A細胞縫隙連接功能的影響

湯南1,萬潔2,陳博2,張媛3,陳鴻鵬4

(1廣東醫科大學藥學院，廣東東莞 523808； 2廣東醫科大學基礎學院；3暨南大學附屬第一醫院；4廣東醫科大學信息工程學院)

目的觀察紫杉醇、多西紫杉醇對大鼠肝細胞株BRL-3A細胞縫隙連接(GJ)功能的影響。方法采用磺酰羅丹明B比色法篩選紫杉醇和多西紫杉醇不影響BRL-3A細胞生長的作用濃度。采用細胞接種熒光示蹤法與劃痕標記染料示蹤技術檢測紫杉醇與多西紫杉醇作用BRL-3A后細胞GJ功能。結果篩選出的紫杉醇、多西紫杉醇藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。與溶劑對照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，多西紫杉醇處理的BRL-3A細胞Calcein熒光傳遞率無明顯變化。與溶劑對照組相比，紫杉醇作用細胞后LY向鄰近細胞傳遞距離縮短，多西紫杉醇作用細胞后LY向鄰近細胞傳遞距離無明顯變化。結論紫杉醇可顯著抑制大鼠肝細胞株BRL-3A細胞GJ功能，而多西紫杉醇則不影響GJ功能。

紫杉醇；多西紫杉醇；細胞縫隙鏈接；肝細胞株；BRL-3A細胞

細胞縫隙連接(GJ)是相鄰細胞間進行直接信號與物質交流的膜通道，由連接蛋白(Cx)組成。6個Cx亞單位環行排列組成一個“連接子”，其中心形成一個孔道[1]。相鄰細胞膜上的兩個“連接子”對接后組裝為一個GJ通道，分子量﹤1～2 kDa的小分子或第二信使等物質可通過GJ在毗鄰細胞間擴散、傳遞和轉運[2]。GJ所介導的細胞間直接接觸的通信方式是細胞生物學行為的重要調控形式，在細胞的新陳代謝、增殖分化、維持內環境穩定等生理過程中發揮重要作用。紫杉烷類抗腫瘤藥物——紫杉醇與多西紫杉醇是目前臨床上廣泛使用的一類廣譜化療藥，對乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌及非小細胞肺癌等有較好的療效。但作為細胞毒類抗腫瘤藥，它們在殺傷癌細胞的同時，對機體正常細胞及組織器官也有一定的損害，其中對肝臟的損傷引起研究人員越來越多的關注[3～6]。肝細胞中分布較多的GJ，觀察紫杉醇與多西紫杉醇對肝細胞GJ連接功能的影響，可為紫杉烷類抗腫瘤藥物肝損傷的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑、儀器及細胞株紫杉醇與多西紫杉醇(Sigma-Aldrich公司)；Calcein-AM及CM DiI(Invitrogen公司)；熒光黃(LY，Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養基，新生牛血清，0.25%胰酶和青-鏈霉素(Gibco公司)；其他試劑均為常用分析純。酶標儀(美國BioTek公司)，IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。實驗所用大鼠肝細胞株BRL-3A購自ATCC。

1.2紫杉醇、多西紫杉醇給予方法及其對BRL-3A細胞GJ功能的影響采用磺酰羅丹明B比色法(SRB法)對紫杉醇、多西紫杉醇的劑量(不引起細胞毒性)進行篩選，確定合適藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。采用以下兩種方法觀察紫杉醇、多西紫杉醇對BRL-3A細胞GJ功能的影響。①細胞接種熒光示蹤法：將BRL-3A細胞接種于12孔板，待細胞生長融合后，分別加入0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L的紫杉醇和0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇作用1 h，同時設立溶劑對照組(采用溶劑處理BRL-3A細胞)。取其中一孔空白細胞加入熒光指示劑Calcein-AM孵育30 min，作為“供體細胞”。胰酶消化收集熒光標記好的“供體細胞”，接種到已生長融合的其他孔BRL-3A細胞(“接受細胞”)上,培養4 h。用熒光顯微鏡計數1個“供體細胞”周圍含有Calcein的“接受細胞”數，與溶劑對照組比較，計算Calcein熒光傳遞率。②劃痕標記染料示蹤技術：將BRL-3A細胞接種于6孔板，待細胞生長融合后，加入1.0 μmol/L的紫杉醇和1.0 μmol/L的多西紫杉醇作用1 h，同時設立溶劑對照組(采用溶劑處理BRL-3A細胞)，吸去6孔板中的培養液，PBS洗3次，每孔加入300 μL 0.5% LY，用手術刀片迅速做一劃痕，將6孔板避光孵育3 min，PBS洗3次后熒光顯微鏡下觀察LY的傳輸距離。

2　結果

與溶劑對照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，分別為82.48%±4.75%、80.20%±5.09%、78.90%±7.74%和73.75%±9.85%。與溶劑對照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇處理的BRL-3A細胞Calcein熒光傳遞率分別為100.67%±1.00%、102.35%±3.93%、96.40%±6.60%、94.12%±10.51%。與溶劑對照組相比，紫杉醇作用細胞后LY向鄰近細胞傳遞距離縮短(約4層)，多西紫杉醇作用細胞后LY向鄰近細胞傳遞距離無明顯變化(約7層)。

3　討論

抗腫瘤藥物所致肝損傷在所有藥物性肝損傷中占很大比重。紫杉醇和多西紫杉醇是目前公認的對多種腫瘤具有確切療效的廣譜化療藥物，肝臟是二者代謝的主要臟器，該類藥物導致的肝損傷將不可避免地直接干擾其體內代謝過程，從而影響療效發揮。目前，關于紫杉醇和多西紫杉醇引起肝損傷的機制研究僅有較少的報道，主要認為是與ROS自由基等有害物質引起的氧化應激反應有關[7,8]。

GJ是相鄰細胞間形成的一種可以開放和關閉的膜通道結構，GJ通信是生物體內細胞之間直接的信息交流，小分子物質及某些信號分子可以通過GJ在細胞間傳遞。GJ廣泛存在于實質性臟器組織(如肝臟、心臟、腎臟、肺等)中。組成GJ的Cx目前在哺乳動物中發現有21種[1]，Cx依據其分子量進行命名。不同Cx組成的GJ通道對物質和信號的傳遞具有選擇通透性。ATP和谷氨酸易于通過Cx43通道，而三磷酸肌醇和腺苷則易通過Cx32通道[9～11]。這種選擇通透性與GJ調節的生理功能有關，GJ通道功能改變將影響細胞之間的正常通信，從而導致疾病發生。研究[12～14]證實GJ異常與腫瘤、血栓、癲癇等多種疾病的發生有關。在大多數腫瘤的形成階段常伴隨著GJ功能的降低或消失，改善或恢復腫瘤細胞的GJ功能可增強順鉑、奧沙利鉑等抗腫瘤藥物的細胞毒性[15]。這可能與GJ介導的“損傷信號”傳遞有關。

肝細胞中富含Cx32組成的GJ[16～18]，由于GJ在物質和信號傳遞中的重要調節作用，近年來GJ與藥物性肝損傷的關系引起研究人員的關注。本研究發現，在不引起細胞毒性的條件下，紫杉醇抑制肝細胞的GJ功能，而多西紫杉醇對此GJ功能則無明顯影響。兩藥顯示出的不同作用，將可能體現出信號分子在肝細胞間傳遞的差異性，這為二者肝損傷的研究提供了新的方向。

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國家自然科學基金資助項目(81400619)；廣東省醫學科研基金資助項目(A2014472，A2013428)。

陳鴻鵬(E-mail： chenhpgdmc@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.009

R73

A

1002-266X(2016)23-0031-03

2015-11-26)