細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病化療抵抗中的作用

蘇莉，呂壯偉，蘇敏

(1新鄉醫學院第二附屬醫院，河南新鄉453003；2新鄉醫學院第三附屬醫院)

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細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病化療抵抗中的作用

蘇莉1，呂壯偉2，蘇敏1

(1新鄉醫學院第二附屬醫院，河南新鄉453003；2新鄉醫學院第三附屬醫院)

摘要：目的以長春新堿(VCR)處理的人急性B淋巴細胞白血病細胞(BLCs)為模型，研究細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)化療中的作用。方法將BLCs隨機分為對照組、藥物組、阻斷組和聯合組，分別加入等體積的PBS、1 μg/mL的VCR、10 mmol/L的細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA處理48 h，采用WST-1法測算細胞增殖抑制率，免疫印跡法檢測自噬相關蛋白輕鏈3β(LC3β)。結果處理細胞48 h后，藥物組、阻斷組和聯合組細胞增殖抑制率分別為9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；各組間兩兩比較，P均<0.01。對照組、藥物組、阻斷組和聯合組LC3β蛋白表達量分別為0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，藥物組高于其他組(P均<0.01)，其余各組間比較無統計學意義。結論細胞自噬可在ALL化療過程中活化導致化療抵抗。

關鍵詞：急性淋巴細胞白血病；細胞自噬；自噬相關蛋白輕鏈3β；化學療法；耐藥；3-甲基腺嘌呤；兒童

細胞自噬是一種生理調節和進化保守的過程，在真核細胞胞質蛋白和大分子物質降解中起關鍵作用。盡管自噬在一些疾病尤其是感染性疾病中發揮抗感染作用[1]，甚至在免疫系統發育中也起關鍵作用[2]；但研究也表明，自噬經常在化療或放療的腫瘤細胞中激活[3]，這可能是腫瘤細胞應對治療并生存的一種策略，因此自噬可能是腫瘤治療的一個靶向[4]。急性淋巴細胞白血病(ALL)是兒童時期最常見的一類白血病，聯合化療后仍有約20%的患兒因高度耐藥而復發，尤其是急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)。過去認為，這是治療后一些耐藥基因如多藥耐藥基因高表達的后果[5]，但常在治療后活化的細胞自噬與兒童ALL藥物抵抗是否有關尚不十分清楚。2014年1月～2015年6月，我們以長春新堿(VCR)處理的人急性B淋巴細胞白血病細胞(BLCs)為模型，研究細胞自噬在兒童B-ALL化療過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料BLCs與培養試劑，ECL發光試劑盒，WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術有限公司；兔抗人自噬相關蛋白輕鏈3β(LC3β)、β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記羊抗鼠二抗購自北京中杉公司；CD19-FITC及同型對照、Alexa647標記的羊抗兔二抗購自BD公司；長春新堿(VCR)、細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1BLCs增殖情況觀察96孔板加入BLCs細胞5×103/孔(100 μL)，隨機分為對照組、藥物組、阻斷組和聯合組，分別加入等體積的PBS、1 μg/mL的VCR[6]、10 mmol/L的3-MA、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA，每組8個復孔。處理48 h后采用WST-1法檢測細胞吸光度(A)值，按試劑盒說明書操作；實驗重復3次，取平均值。細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.2BLCs中LC3β蛋白檢測于24孔板加入5×105/mL的BLCs細胞懸液1 mL，其分組與處理同1.2.1。處理48 h后提取蛋白，采用免疫印跡法檢測β-actin及LC3β蛋白；一抗1∶1 000稀釋，4 ℃過夜；二抗1∶1 000稀釋，室溫孵育1.5 h；ECL發光后拍照，以LC3β與β-actin蛋白條帶光密度比值表示目的蛋白相對表達量。

2結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較處理細胞48 h后，藥物組、阻斷組和聯合組細胞增殖抑制率分別為9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；組間兩兩比較，P均<0.01。

2.2各組LC3蛋白表達量比較處理細胞48 h后，對照組、藥物組、阻斷組和聯合組LC3蛋白表達量分別為0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，藥物組高于其他組(P均<0.01)，其余各組間比較無統計學意義。

3討論

細胞自噬是目前生命科學研究的熱點之一，尤其是在腫瘤和應激方面。雖然研究發現了一些自噬標志性的基因如LC3β[7]，以及一些重要的參與自噬的基因如高遷移率族蛋白1[8]，但是自噬在腫瘤細胞中的作用沒有得到很好的解釋，尤其是當受到各種應激壓力時，包括化療。Tang等[6]研究顯示，抗癌藥物VCR可通過氧化-還原調節胰腺癌細胞Panc02和結直腸癌細胞HCT116的自噬反應，影響其抗腫瘤療效，這提示自噬是腫瘤化療抵抗的關鍵因素之一。

LC3β是公認的細胞自噬的標志物，其功能涉及微管裝配和細胞質中細胞器降解，在正常細胞中表達極少，但在應激、化療等誘發的細胞自噬中均呈高表達。本實驗在模擬ALL化療的體外模型中發現，微管蛋白聚合抑制劑VCR處理BLCs后，一方面表現為強大的抗瘤能力，腫瘤細胞大量死亡；但是，另一方面也伴隨著LC3β表達的逐漸增強，即化療后誘導的細胞自噬活化。由于自噬的本質是細胞通過吞噬不必要的細胞器以保證細胞度過外界的應激，提示在ALL化療中存在的細胞自噬可能是化療抵抗的一個重要原因。研究表明，3-MA可通過抑制PI3K-mTOR信號通路抑制自噬的發生[9]。為了驗證以上假說，本課題應用了細胞自噬的抑制劑3-MA，結果表明3-MA可明顯抑制VCR誘導的自噬現象，同時伴有細胞增殖抑制率的明顯升高，進一步說明了自噬是VCR誘導化療抵抗的關鍵因素。研究發現，腫瘤細胞對化療藥物的應答主要有兩條途徑，其中一條是細胞凋亡，如一些氧化態蛋白的表達，進而誘導Caspase。在臨床治療ALL的過程中，盡管80%的患者可獲得不錯的療效，但仍有少部分患者因化療耐藥而復發。研究已經表明，少量殘存的腫瘤細胞是臨床化療后復發的一個重要因素[10]。結合本實驗，我們認為ALL化療失敗患者可能是因為化療時腫瘤細胞自噬活化，少量腫瘤細胞因此度過化療，化療結束后又大量擴增，進而造成臨床上的耐藥復發。

抑制細胞自噬，進而提高血液腫瘤化療效果，可能成為未來血液腫瘤治療的靶點[11]。雖然本實驗發現了ALL治療過程中存在著因細胞自噬而發生的化療抵抗，可能是耐藥復發的關鍵因素，但仍需要進一步研究導致自噬在化療中激活的分子機制，例如PI3K-mTOR信號通路[12]、NF-κB途徑[13]，這將為靶向自噬的新型藥物在臨床應用提供依據。

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Role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of children with B-cell acute lymphocytic leukemia

SULi1,LYUZhuangwei,SUMin

(1TheSecondAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:ObjectiveWe take the human B-cell acute lymphocytic leukemia cells (BLCs) treated with vincristine (VCR) as the models to investigate the role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL).MethodsBLCs were randomly divided into the control group, experimental group, blocker group and union group, which were respectively treated with the same volume of PBS, 1 μg/mL VCR, 10 mmol/L 3-methyladenine (3-MA) and 1 μg/mL VCR+10 mmol/L 3-MA for 48 h. Transmission electron microscope was used to detect the autophagosome, WST-1 was employed to calculate the proliferation inhibitory rate and Western blotting was performed to detect the autophagy-related protein light chain 3β (LC3β) expression. ResultsThe inhibition rates after 48 h treatment in the experimental group, blocker group and union group were 9.7%±3.3%, 63.4%±9.1% and 80.6%±8.3%, respectively (all P<0.01). The LC3β expression in the control group, experimental group, blocker group and union group was 0.02±0.01, 0.31±0.05, 0.01±0.01 and 0.02±0.01, respectively, and the experimental group was higher than the other groups (all P<0.01), no significant difference was found among the other three groups. ConclusionAutophagy can be activated during chemotherapy of ALL, leading to chemotherapy resistance.

Key words:acute lymphoblastic leukemia; autophagy; autophagy-related protein light chain 3β; chemotherapy; drug-resistance; 3-methyladenine; child hood

(收稿日期：2015-10-24)

中圖分類號：R557.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.007

作者簡介：第一蘇莉(1975-)，女，碩士，主管檢驗技師，主要研究方向為血液病檢驗。E-mail: suli_1975@163.com

基金項目：河南省教育廳自然科學基金項目(13A310843)；新鄉醫學院重點研究領域招標課題項目(ZD2011-12)。