洞庭湖區東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）對土壤鎘污染反應特征初探

董萌，周小梅，李必才，庫文珍湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413000

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洞庭湖區東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）對土壤鎘污染反應特征初探

董萌，周小梅，李必才，庫文珍
湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413000

摘要：如何利用較為科學、合理的技術方法，對土壤中的鎘污染及其修復效果進行監測與評價，是植物修復土壤鎘污染實際操作中存在的重要問題。該研究基于東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）對鎘的敏感性反應特征，初步探索一種適用于土壤鎘污染的生物監測方法。以含鎘背景值相對較低的土壤作為栽培基質，采用梯度質量分數鎘脅迫的方式進行研究，結果表明，（1）當土壤中的鎘質量分數大于2～3 mg·kg-1時，東亞金發蘚植株孢子體和配子體的外觀形態在短時間內呈現出顯著變化特征；隨鎘質量分數的增加和時間的延長，小葉受害程度加深，出現黃化或褐變現象，測定期內5 mg·kg-1的鎘處理最終可使植株枯亡。（2）葉綠素含量受鎘脅迫影響顯著，且對鎘脅迫時間反應較為迅速：2 mg·kg-1以內的鎘處理下，葉綠素含量在7 d中的變化均不大；鎘質量分數大于3 mg·kg-1時，對葉綠素含量影響顯著，且隨時間延長葉綠素下降程度更加明顯；4 mg·kg-1的鎘處理可使葉綠素含量下降3/4以上。（3）鎘脅迫導致植物體內可溶性蛋白含量顯著降低，處理初期可溶性蛋白含量變化不大，后期則變化明顯，可導致蛋白含量減少40%～50%；同時細胞膜脂過氧化作用顯著增強（表現為MDA濃度上升），MDA含量增加了1.8倍以上。（4）東亞金發蘚葉綠素含量、可溶性蛋白含量及MDA含量等生理參數的變化，可有效指示土壤中鎘的生物有效性，并能反映土壤鎘安全濃度標準。（5）東亞金發蘚的假根對土壤中的鎘具有較強的感應能力，植株易受到鎘離子毒害并快速、直觀地表現出一系列癥狀，因此可作為有效監測土壤鎘污染的理想植物材料。

關鍵詞：東亞金發蘚；鎘污染；生理反應特征；生物監測

DONG Meng,ZHOU Xiaomei,LI Bicai,KU Wenzhen.Primary Experimental Study on the Response Characteristics of Pogonatum inflexum on Cd-contaminated Soil of Dongting Lake Area [J].Ecology and Environmental Sciences,2016,25(1):124-129.

當前，土壤鎘污染已成為困擾許多國家糧食安全和人類健康的世界性環境問題，受到越來越廣泛的關注。利用生態而又經濟的植物提取修復法來消除或降低土壤中的鎘污染，一直是國內外學者研究的熱點（Bolan et al.，2014；Ali et al.，2013；Witters et al.，2012；Rajkumar et al.，2012）。然而，如何相對客觀、準確地評價鎘污染土壤修復后的效果與質量，已成為實際操作中亟待解決的問題。對此，較多的研究（Wang et al.，2014；Remon et al.，2013；Tariq et al.，2013）認為，利用化學試劑提取法測定出修復后土壤中鎘的總含量及有效態含量，可作為衡量土壤修復效果的評價依據；但也有學者（Remon et al.，2013；Serbula et al.，2012；Geraskin et al.，2011；Das et al.，1997）提出，僅從鎘含量值的角度來反映土壤修復效果及其生態安全性并不十分真實，修復后的土壤是否已達到安全標準，最終應以生長于其中的植物體自身狀態及生長反應作為判斷依據。總體而言，目前為止尚缺乏一種較為理想、科學的檢測方法，用以評價土壤鎘污染的修復效果和生物安全性。

本課題組在針對洞庭湖濕地鎘污染的長期研究和資源調查中，發現一種生長密集的苔蘚植物，經鑒定為金發蘚科的東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）。野外調查及分析結果表明，在洞庭湖區凡有東亞金發蘚分布的地帶，其土壤中總鎘含量值一般在2.0 mg·kg-1以下，鎘污染嚴重的地帶則未見有該苔蘚生長；土壤梯度鎘脅迫培養實驗表現出同樣的結果。綜合說明東亞金發蘚對土壤基質中的鎘具有較強的敏感性。本研究認為，利用某種對鎘具有較低耐受性的生物體，通過其生長狀況和生理反應來指示土壤鎘污染及修復效果，具有較強的直觀性和說服力；充當這一檢驗標準的生物體，個體大小應適宜，組織進化程度盡可能簡單，易受到環境毒害并表現出癥狀。東亞金發蘚符合上述特征。基于此，本研究初步探索了東亞金發蘚在不同程度鎘污染土壤中的生長反應特征，以期開發一種新的土壤鎘污染生物監測方法，為科學監測和檢驗土壤鎘污染及修復效果提供理論基礎和技術依據。

1　材料與方法

1.1供試植物材料來源

研究對象——東亞金發蘚植株源材料采自南洞庭湖濕地的東南洲（28°52′34.14″N，112°23′39.36″E）和安瀾閣（28°81′29.17″N，112°49′24.31″E）兩處，采集地點表層土壤（0～3 cm）中鎘的背景值含量分別為0.371和0.422 mg·kg-1；采集方式為小塊區域水平鏟集法（東亞金發蘚基部叢集群生），植株根部帶土厚度約2 cm；源材料帶回實驗室后放置于水箱中的網狀支架上，根部浸沒于水中并輕微搖動數小時，盡量保持根部結構不受損傷，去除根部泥土后移植于經過處理的淺盤土壤基質中。

1.2土壤基質的基本理化性質與處理

用于移植東亞金發蘚的土壤基質，取自上述植株源材料的采集地點，土壤經風干、碾碎、過篩后，分別采用原子吸收分光光度法、凱式定氮法、鉬銻抗分光光度法、火焰分光光度法、BaCl2-MgSO4交換法和酸度計法（鮑士旦，2000）測定了土壤基質中的全鎘、全氮、全磷、全鉀、陽離子交換量和pH值。所測得土壤基本信息見表1。

表1　供試土壤基本理化性質Table 1　Basic properties of the tested soil

分別稱取2.0 kg土壤基質，平鋪于直徑35 cm、高6 cm的聚乙烯淺盤內；溶解一定量的Cd(NO3)2·4H2O（分析純）施入，充分混勻，使淺盤內土壤基質外源Cd添加的質量分數分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·kg-1，分別對應Cd1、Cd2、Cd3、Cd4、Cd5處理，以零添加（Cd0）作為對照；每個處理濃度設置5個重復，自然放置平衡14 d后進行植株移植。

1.3樣品取材與參數測定

東亞金發蘚植株移栽至淺盤后，放置于接近自然環境的網室培養架上，根據每天的光照、溫濕度等環境條件情況，定時噴灑300～500 mL自來水于每盤中。自移植后的第2天（在本實驗中設為第1天）開始觀察、記錄東亞金發蘚植株的形態學特征及外觀生長反應，包括植株整體長勢、小葉數量、發育狀況、配子體與孢子體受害表征、褐變與致死情況等，直至研究過程結束。

在實驗第1天、第2天、第3天、第5天和第7天剪取東亞金發蘚植株帶莖小葉，并參照相關測定方法（Li et al.，2013；Sree et al.，2015；婁玉霞等，2010），用于下列生理參數的測定（東亞金發蘚小葉由單層細胞構成，葉面輕薄且貼莖生長，生物量小，不易單獨剪取；莖細胞構造均一且無真正維管束，主要起支撐作用和光合作用）。

1.3.1葉綠素總含量

采用乙醇-丙酮混合液研磨、提取、過濾后，分光光度計法測定。

1.3.2可溶性蛋白含量

按照“0.1 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH為7.8，含1%的聚乙烯吡咯烷酮）研磨后經8000 r·min-1離心”的方式制得粗酶液后，采用考馬斯亮藍G250比色法測定。

1.3.3膜脂過氧化程度

以丙二醛（MDA）含量表示。按照前述方式制得粗酶液后，采用硫代巴比妥酸比色法（TBA法）測定。

1.3.4數據統計與分析

所測得原始數據用Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行統計分析處理，處理后數據以“平均值±標準差”的形式給出。

上述可溶性蛋白含量與丙二醛含量的測定過程均按照試劑盒說明書進行，測定結果依據說明書中所列公式計算，所用試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2　結果與分析

2．1東亞金發蘚在鎘污染環境中的外觀特征

本研究中，東亞金發蘚對其根部所處的鎘環境表現出了顯著反應特征，（1）需首先說明的是，在整個形態學觀測階段，東亞金發蘚株高變化不明顯，雄株高度一般在3.0 cm左右，雌株的孢子體寄生于配子體上，整體高度均在8.4～9.1 cm范圍內，特別在后期盡管受到高濃度的鎘離子毒害，但植株高度仍未受到顯著影響。其原因一方面因為該苔蘚植物本身生長較緩慢，加之本觀測過程持續時間較短（共9 d），植株未表現出生長高度的差異；另一方面可能因實驗所用植物材料處于有性生殖期的孢子體世代，該時期植株生長發育基本完成，故很難再受到外界環境脅迫的影響。（2）東亞金發蘚小葉數量變化不大，但受害癥狀明顯。觀測期內，每株的小葉總數量約為75～90 片，整個過程未見有新葉長出；第2天時，4.0 mg·kg-1鎘處理的植株，其最下方的小葉開始出現黃化，5.0 mg·kg-1鎘處理的底部小葉黃化程度更加明顯；第5天時，這兩種濃度鎘脅迫下植株小葉的受害數量增多、黃化程度加重，5.0 mg·kg-1鎘處理的小葉已發生褐變，經放大鏡觀察顯示小葉邊緣枯萎卷曲，而此時3.0 mg·kg-1鎘處理的植株小葉亦開始出現黃化癥狀；至第9天觀察結束時，最高鎘濃度處理的植株小葉只有少量未發生褐變，4.0 mg·kg-1鎘處理的植株有一半以上的小葉發生黃化褐變，3.0 mg·kg-1鎘處理的小葉褐變率在20%左右。（3）鎘脅迫下東亞金發蘚孢子體受害明顯，孢蒴及蒴柄顏色發暗、變軟，至實驗結束時，高濃度鎘脅迫下已有較多的植株出現蒴柄彎折、孢蒴掉落現象，整株呈枯亡狀態。國內外學者的相關研究結果表明，在利用苔蘚或其他一些較低等的植物（如附生植物鐵蘭）進行大氣污染監測時，植物體外在的形態學變化可作為重要的監測衡量標準，這是因為此類植物的組織進化和器官分化程度低，受到外界污染毒害時能快速、直觀地表現出癥狀（Li et al.，2015；Sree et al.，2015）。

2.2東亞金發蘚在鎘脅迫下的葉綠素含量變化

本研究從葉綠素含量的角度揭示了東亞金發蘚受鎘毒害后的生理反應。通過表2數據可知，東亞金發蘚葉綠素含量隨鎘濃度增加呈現顯著下降趨勢，而且在質量分數大于3 mg·kg-1時，隨時間的延長葉綠素下降程度更加明顯；鎘處理的質量分數在2 mg·kg-1以內，葉綠素含量在7 d中的變化均不大，說明東亞金發蘚能耐受土壤中質量分數低于2 mg·kg-1的鎘，這與前面所描述的植物體外觀生長反應相一致。但不同的是，葉綠素對鎘的反應變化在時間上要早于外觀形態，在第1天時即表現出了顯著差異（5 mg·kg-1鎘處理下的葉綠素含量值相比對照降低了40%以上）；在整個過程中葉綠素下降幅度最大的是4 mg·kg-1鎘處理下第7天時的植株（5 mg·kg-1鎘處理第7天時植株已處于枯亡狀態，故不作比較），葉綠素含量整體下降了3/4，說明處理時間越長，鎘濃度效應越明顯。對于葉片暴露在含重金屬顆粒豐富的空氣中的苔蘚類植物而言，其葉綠素含量受環境脅迫影響較為明顯，因為這些植物的葉表面缺少蠟質層和角質層保護，對空氣中的污染性金屬粒子及揮發性有機物特別敏感，這也是將該類植物用于大氣環境污染監測的重要原因之一（Giordano et al.，2013；Rai，2013；Conti et al.，2001）。葉綠體作為葉部主要細胞器，較容易受到污染物傷害而表現出結構上的癥狀，這在大羽蘚、彎葉灰蘚等多種苔蘚植物的研究中已有報道（魏海英等，2003、2005）。此外，國內外學者對大氣監測植物匍枝青蘚、鐵蘭，以及水體監測植物浮萍、狐尾藻等的研究結果（Harguinteguy et al.，2015；Basile et al.，2015；Appenroth et al.，2010；婁玉霞等，2010）也表明，鎘、鉛、鎳等重金屬對這些植物的葉綠素含量均有顯著影響。在這些研究中，植物體的受脅迫部位所處于的生長環境雖然不同（大氣或水體），但均能直接或間接通過破壞葉綠體結構進而降低葉綠素含量。本研究對象東亞金發蘚，其葉綠素含量無論在鎘處理時間還是處理濃度上，均有較快速且顯著的變化，因此可作為該植物受鎘毒害的敏感監測指標，用于指示土壤中的鎘污染程度。

表2　觀測期內植株在鎘脅迫下的葉綠素總含量Table 2　Total content of chlorophyll of tested plants under Cd stress in the observation period

2.3鎘脅迫對東亞金發蘚可溶性蛋白含量的影響

植物體內可溶性蛋白的積累狀況，在一定程度上能說明植物的生長變化及對逆境脅迫的反應（Qureshi et al.，2013；Xu et al.，2008）。由表3可知，在正常基質中生長的東亞金發蘚，其莖葉部的可溶性蛋白含量約在280～290 ug·g-1范圍內；在第1天和第2天，高濃度的鎘脅迫雖對其蛋白含量造成一定影響，但總體變化不大（共減少了6%～9%），但隨著時間延長則產生了顯著差異（在第5～7天時可導致蛋白含量減少40%～50%）。由此可見，東亞金發蘚體內可溶性蛋白在脅迫的早期階段對鎘反應并不敏感，在后期卻能較顯著地表現出差異，其整體下降趨勢與葉綠素含量變化基本一致，但相比而言葉綠素在鎘脅迫時間上反應更為迅速。相關研究報道顯示，大氣中含鎘、鉛的重金屬顆粒長時間作用于附生植物鐵蘭，其葉片中可溶性蛋白含量下降了36.8%，進而影響到植物生長和營養物質積累；3 mmol·L-1以上的水體鉛-鎘復合污染可使紫葉浮萍葉部可溶性蛋白降低40%～46%（Basile et al.，2015）；大灰蘚、彎葉灰蘚等指示植物種類在受到培養液中鎘、鉛脅迫時也產生同樣結果（徐燕云等，2010；魏海英等，2003）。綜上，可溶性蛋白含量指標可作為評價東亞金發蘚對鎘反應的有效參數之一。

表3　觀測期內植株體在鎘脅迫下的可溶性蛋白含量Table 3　Soluble protein content of tested plants under Cd stress in the observation period

表中數據后的小寫字母代表各組數據間的顯著性差異水平（P＜0.05），大寫字母代表各組數據間的極顯著性差異水平（P＜0.01）；測試重復樣本數n=9

2.4鎘脅迫下東亞金發蘚細胞受傷害程度分析

細胞在逆境脅迫下的受傷害情況可通過膜脂過氧化程度來反應，所生成丙二醛（MDA）的含量可間接表達出這一生理過程（Bernard et al.，2015；Ove?ka et al.，2013；Li et al.，2013）。圖1所示的MDA濃度增長變化，較好地反映了東亞金發蘚細胞受不同梯度鎘脅迫的傷害狀況。當鎘處理質量分數大于3 mg·kg-1時，顯著誘導了MDA的生成，在處理第1天即有顯著增加，說明東亞金發蘚細胞膜作為保護原生質體免受傷害的第一道屏障，對鎘離子的反應敏感且快速；第5天時，高濃度的鎘脅迫導致MDA含量增加了1.8倍，反映出東亞金發蘚細胞在該階段受傷害最為嚴重。對鐵蘭、浮萍、狐尾藻等大氣和水體監測植物的短期生態毒理學研究表明，MDA含量可有效指示植物體所受環境中重金屬的脅迫程度（Sree et al.，2015；Basile et al.，2015；Harguinteguy et al.，2015）。因此，MDA同葉綠素一樣，在短時間內可作為東亞金發蘚對土壤鎘污染的有效監測指標。

圖1　東亞金發蘚在鎘脅迫下的MDA含量變化Fig.1　Change of MDA content of tested plants under Cd stress

3　討論

3．1土壤鎘污染及其生物有效性評價

土壤鎘污染包含兩個方面，一是土壤中鎘的總量及有效態含量的大小，二是土壤中的鎘離子所表現出的污染毒性。較多研究（Tariq et al.，2013；Reeves et al.，2008；Hernández et al.，2008；Brown et al.，2004）認為，土壤中鎘的總含量值雖可作為衡量污染程度的重要依據，但鎘的生物有效性則是更科學的評價參數。原因在于，土壤中真正對植物生長造成影響的鎘含量，主要取決于能被植物體吸收利用的那部分有效態成分而非其總量。目前對此常用的是化學測定法，即通過螯合劑等化學試劑提取有效態鎘的方式進行（Wang et al.，2014；Lestan et al.，2008）。相比而言，化學測定方法除了操作過程繁瑣、測定條件誤差等缺點外，它對鎘的生物有效性的評價，僅能通過含量值來間接表達，并不能真正反映土壤的生態安全系數，由此方法所制訂的鎘安全濃度標準值也不一定適合于在土壤中實際生長的作物。況且重金屬鎘長期存在于土壤中，所形成的各種化學形態之間伴隨著吸附-解吸、溶解-沉淀、氧化-還原、甲基化-去甲基化等多種動態理化過程而不斷相互轉化，其毒性大小時刻發生著變化（Bolan et al.，2014），因此對鎘的生物學毒性不宜直接通過含量值測定的方式進行定性評價。近年來有不少學者采用生物監測法來評價鎘污染毒性及修復效果，如歐洲松在修復土壤鎘污染時，其松針中的鎘含量能較好地指示土壤中鎘的生物有效性，同時也能反映出一定的土壤理化性質（Pietrzykowski et al.，2014）；利用玉米植株處理含鎘的廢液后，可根據其葉片中葉綠素熒光值變化及廢液對青藻菌光合效應抑制程度來評測修復效果（Lucas et al.，2013）；此外，一些小型動物也被應用于土壤環境的毒理學監測中，例如借助蝸牛、蚯蚓、彈尾目昆蟲以及陸生等足類軟體動物的生長反應，可有效檢驗鎘、鉛污染土壤的修復治理效果（Udovic et al.，2013）。本研究通過東亞金發蘚在梯度鎘脅迫土壤中的生長變化及生理反應來指示基質中有效態的鎘，與化學試劑提取測定法相比，更加直觀地表現了土壤鎘污染的安全濃度標準，即當土壤中鎘質量分數大于2～3 mg·kg-1時，可對植物體造成毒害。

3.2東亞金發蘚用于土壤鎘污染監測的可行性分析

目前，在環境監測中應用最為成熟和有效的是苔蘚植物監測法。國內外學者不僅在監測的方法技術上，而且在監測機理等方面都有較深入的研究。苔蘚、地衣、菌類，以及一些附生植物如鐵蘭等（Abril et al.，2014；Giordano et al.，2013；Lodenius，2013；Serbula et al.，2012；Paoli et al.，2012；葛彥雙等，2013），都被用于對大氣粉塵、重金屬顆粒、有毒有害氣體的污染監測。這些低等植物表面無角質層、蠟質層覆蓋，污染物可直接通過表層薄壁細胞吸附進入，故它們對環境中的重金屬粉塵顆粒、污染性氣體等極為敏感。理論上講，這些植物的假根等器官對表層土壤污染也具有較強的感應能力，土壤重金屬離子可迅速通過假根薄壁細胞而對植物體造成傷害，與利用其地上部分監測大氣污染在原理上具有一定相似性。因此，在利用苔蘚植物監測土壤鎘污染方面值得進行探索試驗。

東亞金發蘚廣泛分布于洞庭湖濕地，繁殖速度快，易取材，具有適于進行土壤鎘污染監測的一系列優勢特征：對環境質量要求高，特別對土壤中的鎘具有較強敏感性，易受到鎘離子毒害并迅速表現出癥狀；植株大小適宜，其孢子體世代的成熟株高可達10 cm以上，易于進行生長指標的觀測；結構簡單，體內沒有真正的維管束，孢子體寄生于配子體上，各器官的細胞構造均一且多為單細胞層，適于進行顯微觀察等（中國科學院植物研究所，1983）。本研究結果顯示，無論從東亞金發蘚植株外觀形態，還是葉綠素含量、可溶性蛋白含量及MDA濃度等生理指標反應來看，該植物對土壤中的鎘具有較強的感應能力，且各指標變化程度較好地對應了土壤中的鎘濃度，因此這些指標適合作為東亞金發蘚監測和評價土壤鎘污染的有效參數。

4　結論

（1）當土壤中的鎘質量分數大于2～3 mg·kg-1時，可使東亞金發蘚植株孢子體和配子體的外觀形態在短時間內呈現出顯著變化特征，同時導致葉綠素含量及可溶性蛋白含量降低、細胞膜脂過氧化作用增強（表現為MDA濃度上升），這些生理反應參數可為東亞金發蘚指示土壤中鎘的生物有效性提供參考依據，并能反映土壤鎘安全濃度標準。

（2）東亞金發蘚的假根對土壤中的鎘具有較強的感應能力，植株易受到鎘離子的毒害并快速、直觀地表現出一系列癥狀，可作為有效監測土壤鎘污染的理想植物材料。

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Primary Experimental Study on the Response Characteristics of Pogonatum inflexum on Cd-contaminated Soil of Dongting Lake Area

DONG Meng,ZHOU Xiaomei,LI Bicai,KU Wenzhen
College of Chemistry and Environment Engineering,Hunan City University,Yiyang 413000,China

Abstract:Giving a scientific and reasonable methods of monitoring and evaluation of soil cadmium pollution and its remediation effect,is a vital topic in the field of phytoremediation.Present studies were conducted to explore a new bio-monitoring method which was applied to Cd pollution evaluation,based on the sensitive reaction characteristics of Pogonatum inflexum under Cd stress.Soils were used as culture substrate with low background values of Cd,and gradient concentrations of Cd were set and here are the results as follows:(1) Appearance of the sporophyte and gametophyte of Pogonatum inflexum showed significant changes within a short time while the Cd concentrations in soil greater than 2～3 mg·kg-1,and the leaflets of the tested plants fell victim deeper until turn to etiolation or browning along with the Cd pollution level increased,and the plants were withered dead under 5 mg·kg-1of Cd treatment.(2) The chlorophyll content of the plants affected by Cd pollution obviously and responsively,especially as the concentration of Cd was greater than 3 mg·kg-1,reduced more than three-quarters ultimately and exerted rapid response to the processing time of treatment.(3) The soluble protein and MDA content of the plants for test showed the same characteristics under Cd stress,and the change rate obviously speeds up at ending.(4) The above-mentioned three kinds of physiological parameters(that is chlorophyll,soluble protein and MDA)could be suitable for indicating bioavailability and reflecting safety standards of Cd in soil.(5) The Pogonatum inflexum could be used as an ideal plant materials because of the quicklook symptoms under the poisonous effect of Cd,due to the strong ability of induction of rhizoids in Cd contaminated soil.

Key words:Pogonatum inflexum; Cd contamination; physiological characteristics; biomonitoring

收稿日期：2015-10-26

作者簡介：董萌（1982年生），男，博士，副教授，主要研究方向為環境污染與生態修復。E-mail:dongmeng1001@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目（30970551）；湖南省科技計劃重點項目（2010SK2004）

中圖分類號：X171.5

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）01-0124-06

DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.01.018

引用格式：董萌,周小梅,李必才,庫文珍.洞庭湖區東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）對土壤鎘污染反應特征初探[J].生態環境學報,2016,25(1):124-129.