益氣逐瘀方對急性心肌梗死大鼠miR-24表達及心肌細胞凋亡的影響

褚福永 劉 巍 劉紅旭（首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京，100010）

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益氣逐瘀方對急性心肌梗死大鼠miR-24表達及心肌細胞凋亡的影響

褚福永 劉 巍 劉紅旭
（首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京，100010）

摘要目的：觀察益氣逐瘀方參元丹對急性心肌梗死大鼠miR-24表達及心肌細胞凋亡的影響。方法：50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、參元丹高、中、低劑量組，每組10只，采用左冠狀動脈前降支結扎法復制心肌梗死模型，參元丹高、中、低劑量組從術后第2天開始給予參元丹藥液灌胃，假手術組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，共給藥2周。治療結束后檢測大鼠血清CK、LDH水平及心肌組織miR-24基因表達情況，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。結果：實驗結束時，與模型組相比，參元丹高、中、低劑量組均能顯著降低血清CK、LDH水平（P＜0. 05，P＜0. 01），升高心肌組織miR-24 mRNA表達（P＜0. 05，P＜0. 01），同時降低心肌細胞凋亡指數（P＜0. 05，P＜0. 01）。結論：益氣逐瘀方參元丹能夠減輕心肌梗死大鼠心肌損傷及細胞凋亡，其作用機制可能與上調心梗大鼠缺血心肌組織miR-24基因表達有關。

關鍵詞益氣逐瘀方；參元丹；細胞凋亡；miR-24

Effects of Shen Yuan Dan on MIR-24 Expression and Myocardium Cell Apoptosis in Myocardial Infarction Rats

Chu Fuyong，Liu Wei，Liu Hongxu
（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：To observe the effects of Shen Yuan Dan（SYD）on MIR-24 expression and myocardium cell apoptosis in myocardial infarction rats. Methods：Fifty SD rats were randomly divided into five groups，namely sham group，model group，high dose，middle dose，and low-dose SYD group，with 10 rats in each group. The myocardium ischemia models were established by ligating of anterior descending branch of coronary artery. The rats in treatment groups were treated with intragastric administration of SYD. The model and sham group were given 0. 9%sodium chloride solution with the same volume. The treatment lasted for 2 weeks. Serum levels of creatine kinases（CK），lactate dehydrogenase（LDH）and MIR-24 gene expression in ischemic myocardium were measured after the treatment. Myocardial apoptosis was measured by TUNEL. Results：At the end of the treatment，the serum level of CK and LDH significantly decreased in SYD（high，middle and low-dose）groups compared with those of the model group（P＜0. 05，P＜0. 01）. And the MIR-24 mRNA expression in ischemic myocardium were significantly increased in SYD （high and middle-dose）groups compared with those of model group（P＜0. 05，P＜0. 01）. Meanwhile，the myocardial apoptosis index also significantly decreased in STD groups（high，middle，and low-dose）compared with those in model group（P＜0. 05，P ＜0. 01）. Conclusion：Yiqi Zhuyu formula SYD could relieve myocardial injury and cell apoptosis in myocardium infarction rats. The possible mechanism may relate to up regulating MIR-24 gene expression in ischemic myocardium.

Key Words Yiqi zhuyu formula；Shen Yuan Dan；Cell apoptosis；MIR-24

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是心肌急性缺血性壞死，是在冠狀動脈病變的基礎上，發生冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使相應的心肌嚴重而持久的缺血導致心肌壞死，是冠心病的嚴重類型。細胞凋亡是心肌梗死早期細胞損傷的重要病理機制［1］。近期研究表明，作為細胞凋亡信號通路上游的重要的調控分子，miR-24能夠通過抑制靶基因Bim及其下游線粒體細胞凋亡信號通路細胞因子的表達抑制心肌缺血早期細胞凋亡，發揮心肌保護作用［2］。參元丹是我院心內科劉紅旭主任醫師基于冠心病氣虛血瘀的病機特點組方而成的特色院內制劑，目前在臨床上廣泛應用于冠心病的治療。本研究通過觀察參元丹對心梗大鼠心肌損傷標志物、細胞凋亡及miR-24基因表達的影響，初步探討參元丹通過干預miR-24減輕心肌缺血細胞損傷的作用機理。

1　材料

1. 1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠50只，體重（220±10）g，雌雄不限，購自北京市維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2013-2014。

1. 2 藥物與試劑 Trizol（Invitrogen）、M-MLV逆轉錄酶（Promega），miR-24逆轉錄試劑盒TransStart? Green qPCR superMix（北京全式金生物技術有限公司），引物設計由Invitrogen公司完成，TUNEL細胞凋亡試劑盒（Roche）。參元丹由丹參、黨參、玄參、地龍、土鱉蟲等組成，來源于北京中醫醫院中藥制劑室。根據課題組前期研究資料［3］，將參元丹除去包衣，溶于蒸餾水中，以10倍量常水煮提3次，30 min／次，合并煮提液，濃縮至含生藥1 g／mL的藥液供用。

1. 3 實驗儀器 小動物呼吸機（成都泰盟科技），全自動生化分析儀（美國BECKMAN），臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf），ABI 7300 Real time PCR儀（美國ABI），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus），-80℃超低溫冰箱（美國Thermo），TA1003型精密電子天平（上海天平儀器）。

2　實驗方法

2. 1 動物模型制備 采用冠狀動脈前降支結法扎建立大鼠心肌缺血模型，具體方法參照課題組前期研究結果進行［3］，假手術組開胸后只穿線不結扎，術后每只大鼠給予青霉素鈉20萬U／日肌注預防感染。

2. 2 分組與給藥 動物適應性喂養3 d，禁食12 h后進行隨機分組：1）假手術組；2）模型組；3）參元丹高劑量組；4）參元丹中劑量組；5）參元丹低劑量組，每組10只。給藥從術后第2天開始，連續給藥14 d。其中，參元丹高劑量組給予參元丹藥液12 g／（kg ·d）灌胃，中劑量組給予參元丹藥液6 g／（kg·d）灌胃，低劑量組給予參元丹藥液3 g／（kg·d）灌胃，假手術組和模型組分別給予等劑量的生理鹽水灌胃。

2. 3 標本留取 實驗結束時，大鼠戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血3 mL，分離血清。采血后大鼠麻醉處死，去除心房及右心組織，于結扎點以下沿心臟縱軸方向分別橫切三份3～5 mm心肌組織，1份置于4%多聚甲醛溶液內固定24 h，常規石蠟包埋，用于細胞凋亡檢測，另2份分裝入DEPC處理的EP管后放入液氮中，-80℃超低溫冰箱保存待檢。

2. 4 血清CK、LDH檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清CK、LDH水平。

2. 5 心肌組織miR-24 mRNA表達 采用Real time-PCR法檢測心肌組織miR-24 mRNA表達，以U6作為內參。心肌組織總mRNA提取參照Trizol試劑盒說明進行，每個樣本取400 ngRNA模板合成cDNA。miR-24引物序列：上游5′-GCGGCGGTG GCTCAGTACA GC-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6引物序列：上游5′-GCTC GCTTCG GCAGCACA-3′，下游：5′-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3′，PCR反應條件：93℃2 min預變性，93℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，工作40次循環，最后72 ℃7 min延伸，反應結束后，通過產物的溶解曲線判定引物的特異性。調整基線和閾值讀出各孔的循環數（Cycle threshold，Ct），利用比較Ct法檢測各樣本mRNA的表達情況。

2. 6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，具體按試劑盒操作說明進行，正常心肌細胞核被染成藍色，凋亡陽性心肌細胞核被染成棕褐色，光學顯微鏡下每張切片選取具有代表性的10個視野，計數凋亡細胞以及總的心肌細胞核數，計算心肌細胞凋亡指數（Apoptosis Index，AI）。2. 7 統計學方法 采用SPSS 15. 0進行統計分析，所有數據以（±s）表示，計量資料組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用ANOVA方差分析，P＜0. 05視為差異有統計學意義。

3　結果

3. 1 各組大鼠血清CK、LDH水平變化 實驗結束時，與假手術組相比，模型組大鼠血清LDH、CK明顯升高（P＜0. 01），SYD高、中、低劑量組均能顯著降低心梗大鼠血清CK、LDH濃度（P＜0. 05，P＜0. 01），且呈一定量效關系，見表1。

表1　各組大鼠血清CK、LDH含量的比較（±s，n＝10）

表1　各組大鼠血清CK、LDH含量的比較（±s，n＝10）

注：與假手術組比較，**P＜0. 01，與模型組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　CK（U／L）　LDH（U／L）假手術組155. 4±25. 6　176. 6±26. 8模型組　298. 7±23. 1**　374. 5±29. 5**參元丹高劑量組　172. 1±19. 4△△　205. 3±28. 5△△參元丹中劑量組　203. 4±22. 8△△　228. 4±31. 2△△參元丹低劑量組　236. 9±22. 5△　296. 3±25. 3△

3. 2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較 實驗結束時，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著升高（P＜0. 01），SYD高、中、低劑量組均能顯著降低心梗大鼠心肌組織細胞凋亡指數（P＜0. 05，P＜0. 01），且呈一定量效關系，見表2，圖1。

圖1　各組大鼠心肌細胞TUNEL染色結果（×400）

3. 3 大鼠心肌組織miR-24基因表達情況 實驗結束時，與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織miR-24表達水平顯著下降（P＜0. 01）。SYD高、中、低劑量組均能夠升高心梗大鼠心肌組織miR-24表達，其中，SYD高、中劑量組和模型組相比，差異有統計學意義（P＜0. 05，P＜0. 01），見表2。

表2　各組miR-24基因表達情況比較（±s，n＝10）

表2　各組miR-24基因表達情況比較（±s，n＝10）

注：與假手術組比較，**P＜0. 01，與模型組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　miR-24／U6　　凋亡指數（AI）假手術組1. 26±0. 13　 1. 45±0. 96模型組　0. 42±0. 12**63. 56±11. 28**參元丹高劑量組　1. 17±0. 09△△　35. 17±15. 76△△參元丹中劑量組　1. 02±0. 14△　44. 25±14. 99△△參元丹低劑量組　0. 64±0. 16　 56. 28±14. 13△

4　討論

細胞凋亡是一種受基因控制的細胞自身程序性死亡，其激發與抑制受多種基因調控［4］。細胞凋亡在多種心臟疾病中有著重要意義，無論是持續性心肌缺血或缺血后再灌注期均已觀察到明顯的心肌細胞凋亡現象，而缺血早期則以細胞凋亡為主。

miR是一類長約22個核苷酸的進化保守的內源性非編碼單鏈小RNA分子，可在轉錄后水平抑制目標mRNA翻譯或引起其降解發揮基因表達調控功能［5］。在心血管系統，尤其是一些心肌特異性或高表達miR，參與了心臟發育、血管新生、心力衰竭、心肌肥厚以及心律失常等生理和病理生理過程［6］。近期研究表明［2］，miR-24在哺乳動物心肌組織中高表達，并且在小鼠心肌缺血早期表達明顯上調，并可能通過調控其靶基因Bim及其下游線粒體細胞凋亡信號通路關鍵細胞因子基因和蛋白的表達參與了缺血心肌自身修復過程；此外，我們前期的臨床研究也發現，不穩定型心絞痛和急性心肌梗死患者血漿miR-24表達水平明顯低于穩定型心絞痛和健康人群，隨著冠脈病變支數和嚴重程度的增加，miR-24的表達水平呈下降趨勢，由此可見，miR-24與冠心病發病過程關系密切，miR-24在冠心病心肌缺血發病過程中可能發揮了重要的調控作用。

本研究表明，心肌梗死后大鼠心肌組織由于缺血缺氧刺激，心肌損傷標志物和細胞凋亡水平明顯升高，而miR-24表達明顯下調，參元丹可以有效降低心肌梗死大鼠血清CK、LDH的含量，減輕細胞凋亡程度，升高miR-24表達水平，且呈一定量效果關系。本研究結果初步驗證了參元丹可能通過調控miR-24介導的細胞凋亡信號通路發揮心肌缺血細胞損傷的作用機制，為下一步研究益氣逐瘀法在心肌缺血細胞損傷的作用機理奠定了基礎。

參考文獻

［1］Krijnen P A，Nijmeijer R，Meijer CJ，et al. Apoptosis in myocardial ischemia and infarction［J］. Journal of Clinical Pathology，2002，55 （11）：801-811.

［2］Qian L，Van Laake LW，Huang Y，et al. miR-24 inhibits apoptosis and represses Bim in mouse cardiomyocytes［J］. Journal of Experimental Medicine，2011，208（3）：549-560.

［4］Kale J，Liu Q，Leber B，et al. Shedding light on apoptosis at subcellular membranes［J］. Cell，2012，151（6）：1179-1184.

［5］Schirle NT，Sheu-Gruttadauria J，MacRae IJ. Gene regulation. Structural basis for microRNA targeting［J］. Science，2014，346（6209）：608-613.

［6］van Rooij E，Olson EN. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease：opportunities and obstacles［J］. Nature Reviews Drug Discovery，2012，11（11）：860-872.

（2016 -02 -24收稿 責任編輯：洪志強）

中圖分類號：R256. 22

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 005

通信作者：劉紅旭，主任醫師，教授，研究方向：中西醫結合防治心血管疾病基礎與臨床研究，Tel：（010）52176633，E-mail：lhx_＠263. net

作者簡介：褚福永（1981—），男，醫學博士，副主任醫師

基金項目：教育部高等學校博士學科點專項基金（編號：20131107120016）；北京市科委首都特色應用專項（編號：Z131107002213152）；北京市醫院管理局“青苗”計劃專項（編號：QML20150901）；首都醫科大學附屬北京中醫醫院院級課題（編號：2014013）