細(xì)胞直接接觸對新生血管生成調(diào)控作用的研究*

余 楊，吳洪坤，羅永金，喻鵬凌，何 勇，陳 灝

(中國科學(xué)院大學(xué)附屬重慶醫(yī)院/重慶市人民醫(yī)院心血管外科 401121)

缺血性心臟病是目前全球范圍內(nèi)主要的致死性疾病之一[1]。梗死心臟的功能性恢復(fù)主要依賴于側(cè)枝血管網(wǎng)的重建，以供給足夠的含氧血液[2]。盡管缺血早期的再灌注治療(如外科手術(shù)、安裝支架)明顯降低了致死率，但要恢復(fù)并維持心肌正常功能仍然依賴于血管的再生，這也是促血管化治療缺血性心臟疾病的主要策略和目標(biāo)[3]。雖然血管生成和血管生成相關(guān)因子已被廣泛研究，但促血管生成機(jī)制及通路十分復(fù)雜，仍未得到完全闡明[4]。故本研究擬建立有效的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，探尋再血管化的具體調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動物：6～8周齡雄性C57BL/6小鼠10只及1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠20只，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。(2)細(xì)胞：雄性C57BL/6小鼠肺臟分離、純化出的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞及由其心臟分離出的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。(3)主要試劑：胰蛋白酶、DMEM/H完全培養(yǎng)基、10%胎牛血清購自美國Gibco公司；膠原酶Ⅱ購自美國Worthington公司；多肽水凝膠購自上海翌圣公司；四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TMRITC)購自北京百靈威公司；山羊抗兔IgG抗體購自美國Sigma公司；兔抗鼠特異性CD31抗體購自美國BD公司。(4)主要儀器：熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1原代細(xì)胞分離

6～8周雄性C57BL/6小鼠斷髓法處死，暴露胸腔，迅速取出肺臟并切碎，在JAVED等[5]實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用酶消化及免疫磁珠分選法分離、純化小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，保存?zhèn)溆谩?/p>

1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠斷髓法處死，取心臟，充分絞碎，室溫下分別依次置于0.1%胰蛋白酶及0.08%膠原酶Ⅱ中約7 h，徹底消化。吸出細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)皿中靜置約2 h，以便于非心肌細(xì)胞黏附貼壁[6]。剩余細(xì)胞懸液(含心肌細(xì)胞)吸出保存?zhèn)溆谩?/p>

1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠斷髓法處死，解剖暴露心臟，將其取出，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)反復(fù)清洗后，剪成碎末，室溫下于0.25%胰蛋白酶中充分混勻、消化，并靜置后吸出上清液，加入20% DMEM/H完全培養(yǎng)基，終止胰蛋白酶反應(yīng)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，50% CO2)孵育40 min。濾網(wǎng)過濾，棄去未消化的組織碎粒，1 500 g超速離心機(jī)離心5 min，棄去上清液，加入適量PBS，反復(fù)吹打后，再次離心，由此2～3次，最后將分離并富集的心肌成纖維細(xì)胞加入培養(yǎng)基中孵育并保存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2三維細(xì)胞培養(yǎng)

各類細(xì)胞按以下方式分組：內(nèi)皮細(xì)胞+血管內(nèi)皮生長因子組、內(nèi)皮細(xì)胞組、內(nèi)皮細(xì)胞+心肌細(xì)胞組和內(nèi)皮細(xì)胞+心肌成纖維細(xì)胞組。

具體三維培養(yǎng)方法如下：各組細(xì)胞分別接種在置于培養(yǎng)皿中的1%多肽水凝膠支架(多肽序列： AcN-RARADADARARADADA-CNH2)上[8]。內(nèi)皮細(xì)胞+血管內(nèi)皮生長因子組及內(nèi)皮細(xì)胞組內(nèi)皮細(xì)胞接種密度為1.4×106/cm2；內(nèi)皮細(xì)胞+心肌細(xì)胞組及內(nèi)皮細(xì)胞+心肌成纖維細(xì)胞組兩種細(xì)胞按1∶1接種，各細(xì)胞接種密度均為0.7×106/cm2。將10%胎牛血清加入接種于多肽水凝膠支架的各組細(xì)胞中(內(nèi)皮細(xì)胞+血管內(nèi)皮生長因子組中胎牛血清含血管內(nèi)皮生長因子)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育7 d，每2天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.3免疫熒光細(xì)胞染色

于細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出上述4組經(jīng)三維培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄去剩余培養(yǎng)基，0.01 mmol/L pH 7.4 的PBS反復(fù)清洗3次，吸去殘留液體。加入100%冷丙醛37 ℃下固定10 min，PBS洗3次，每次5 min。再加入兔抗鼠特異性CD31抗體(1∶100)，37 ℃下作用30 min，棄去殘留一抗，PBS漂洗3次，每次5 min，最后加入四甲基羅丹明異硫氰酸酯(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶200)，37 ℃下作用30 min，棄去殘留二抗，PBS漂洗3次，每次5 min。滴加甘油緩沖液后，直接于熒光顯微鏡下鏡檢，并攝片記錄[9]，呈紅色熒光為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

內(nèi)皮細(xì)胞組內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞間相互交聯(lián)無明顯增生，無明顯血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成；內(nèi)皮細(xì)胞+血管內(nèi)皮生長因子組、內(nèi)皮細(xì)胞+心肌細(xì)胞組及內(nèi)皮細(xì)胞+心肌成纖維細(xì)胞組內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞間相互交聯(lián)增多，形成了較多的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1。

A：內(nèi)皮細(xì)胞+血管內(nèi)皮生長因子組；B：內(nèi)皮細(xì)胞組；C：內(nèi)皮細(xì)胞+心肌細(xì)胞組；D：內(nèi)皮細(xì)胞+心肌成纖維細(xì)胞組。

3 討 論

缺血性心臟病是由于冠狀動脈粥樣硬化性改變引起血管管腔狹窄或閉塞，造成冠狀動脈血流供應(yīng)與心肌需求間失衡，從而導(dǎo)致缺血性心肌損傷的一大類疾病總稱[10]。心肌缺血會導(dǎo)致心絞痛、心肌梗死、心力衰竭、惡性心律失常，甚至猝死[11]。且長期缺血、缺氧會導(dǎo)致心肌彌漫性纖維化，可造成心肌收縮和舒張功能障礙，此時即使心肌血運(yùn)恢復(fù)，其疾病進(jìn)程也無法逆轉(zhuǎn)[12]。MORAN等[13]通過研究指出，自20世紀(jì)90年代開始，全球年齡標(biāo)準(zhǔn)化的心肌梗死發(fā)病率、心絞痛患病率、全球大部分地區(qū)年齡標(biāo)準(zhǔn)化缺血性心臟病死亡率有所降低，缺血性心力衰竭患病率則升高，但由于人口增長和老齡化的影響，近年來全球缺血性心臟病的疾病負(fù)擔(dān)明顯增加，現(xiàn)已占據(jù)全球死亡原因的第1位。因此，研究心肌重塑過程中血管生成的分子機(jī)制，促進(jìn)早期間質(zhì)血管網(wǎng)再生，對有效延緩并逆轉(zhuǎn)該類疾病有重大的實(shí)際臨床意義。

血管生成是在促進(jìn)因子和抑制因子的共同作用下，內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移，最終形成新生血管和血管網(wǎng)的過程[14]。已發(fā)現(xiàn)的血管生成促進(jìn)因子主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子家族、成纖維細(xì)胞生長因子家族及轉(zhuǎn)移生長因子家族等20多種[15]，而抑制因子包括凝血酶敏感蛋白1、干擾素ɑ/β、血管抑素、16×103泌乳素、血小板因子4等300種[16]。在正常生理?xiàng)l件下，此過程的調(diào)控是由這兩種因子之間的平衡實(shí)現(xiàn)的，通常抑制因子的作用要強(qiáng)于促進(jìn)因子。當(dāng)心肌組織在物理的(壓力或容量超負(fù)荷)、化學(xué)的(缺血或缺氧)及代謝的(多種代謝產(chǎn)物)因素作用下，這一平衡被打破，血管生成因子啟動，通過眾多細(xì)胞信號通路，如Notch信號通路、Netrin1-CD146信號通路、轉(zhuǎn)移生長因子-β信號通路等，以及其一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)反應(yīng)而使細(xì)胞外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移形成管腔，最后結(jié)合相應(yīng)平滑肌細(xì)胞和周圍細(xì)胞構(gòu)成完整的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以使病變組織的微血管密度增加、改善，甚至恢復(fù)其氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)[17]。

綜上所述，雖然血管生成的分子機(jī)制及其通路被廣泛研究，且很多已被證實(shí)[18]，但具體調(diào)節(jié)過程十分復(fù)雜，該領(lǐng)域仍需進(jìn)一步的研究探討。本實(shí)驗(yàn)另辟蹊徑，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，去除血管內(nèi)皮生長因子依然能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖并交聯(lián)形成完整的血管網(wǎng)絡(luò)。該研究揭示了細(xì)胞間直接接觸的促血管化功能，解答了血管生成調(diào)節(jié)領(lǐng)域內(nèi)的又一個疑問，為進(jìn)一步探討細(xì)胞間相互作用在血管生成及其他生理和病理環(huán)境下的功能奠定了基礎(chǔ)。