雨生紅球藻蝦紅素的制備及其穩定性研究*

李學敏， 周慶新， 徐　杰， 楊　魯， 楊　澍， 張　婷， 薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 266003)

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雨生紅球藻蝦紅素的制備及其穩定性研究*

李學敏， 周慶新， 徐杰， 楊魯， 楊澍， 張婷， 薛長湖**

(中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 266003)

摘要：以雨生紅球藻提取物為原料，利用皂化法和溶劑分配法制備蝦紅素，并研究其結構及穩定性。通過優化皂化過程中的堿液濃度、反應時間和反應溫度，得到最佳的工藝條件：堿液濃度7%，皂化時間120min，溫度15℃。此條件下，蝦紅素的轉化率達96.12%，制備的蝦紅素得率為62.16%，純度達80.36%。用HPLC-DAD-(APCI)MS/MS分析反應產物，解析蝦紅素的質譜裂解規律，研究光照條件、金屬離子和溫度對蝦紅素穩定性的影響。結果表明：紫外光照處理對蝦紅素穩定性影響顯著；Fe3+、Ca2+、Cu2+對蝦紅素有不同程度的破壞作用，Zn2+、Mg2+、Na+、Fe2+對蝦紅素影響較小；pH在3～8范圍內，隨著pH升高，蝦紅素穩定性提高；隨著溫度的升高，蝦紅素的保留率下降。本研究為蝦紅素的活性、毒理及其在食品中的應用等研究提供了重要參考。

關鍵詞：雨生紅球藻；蝦紅素；液相色譜-串聯質譜；穩定性

蝦紅素(Astacene，3,3’-dihydroxy-2,3,2’,3’-tetradehydro-β,β’-carotene-β,β-dione)也被稱為喇蛄素，分子式為C40H48O4，屬于非維生素A源類胡蘿卜素的一種[1]，廣泛存在于自然界中，在蝦[2-3]、蟹[4]、鮭魚[5]等水產動物以及藻類植物、花和水果中都有分布。在實際研究過程中，蝦紅素通常作為蝦青素的脫氫氧化產物存在，兩者的結構非常相似(見圖1)。研究發現，蝦紅素結構中長共軛雙鍵鏈末端環上的羥基和酮基以及由其所構成的α-羥基酮，是其發揮各種生物學功能的主要原因[6]。蝦紅素較蝦青素發現晚，目前在這方面研究報道和應用以蝦青素為主，蝦紅素則鮮為報道。由于蝦紅素的吸收特性與其他類胡蘿卜素類似，對動物和人體安全。在日本，蝦紅素已被用于食品和動物飼料中，美國FDA、歐盟、加拿大食品監察局已批準蝦紅素作為水產動物飼料添加劑。國內關于蝦紅素研究應用起步較晚，現在大多還在生產提取研究階段，藥理試驗研究和市場應用較少，研究應用市場前景廣闊。另一方面，蝦紅素具有鮮亮的紅色，并且由于其分子極性低的特性，而使其在油相介質中具有良好的溶解性，加之其特有的生物活性，因此，可作為功能性著色劑用于食品和水產行業。

圖1　蝦紅素的轉化及化學結構[7]

本文以雨生紅球藻為原料，通過皂化和溶劑分配法制備分離蝦紅素，并對其理化特性進行了較為系統的研究，這對今后研究蝦紅素生物活性和構效關系以及將蝦紅素作為功能添加劑用于食品工業具有重要意義。

1實驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻提取物，含蝦青素酯5%，購自云南愛爾發生物技術有限公司；蝦紅素標準品(1mg)，上海臻準生物科技有限公司；甲醇、甲基叔丁基醚均為色譜純，德國Merck公司；KOH、乙醇、二甲基亞砜、二氯甲烷均為國產分析純。

1.2 主要儀器

1100型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器(DAD)和熒光檢測器(FLD)，美國Agilent公司；YMC Carotenoid-C30(4.6mm×250mm，S-5μm)液相柱，日本YMC公司；T10 S25渦旋振蕩器，德國IKA公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋(可震蕩)，國華電器有限公司；DTU-1C氮吹儀，日本TAITEC公司；ALPHA1-4LD冷凍干燥機，德國CHRIST公司；TDL-5-A飛鴿牌系列離心機，上海安亭科學儀器廠制造；6410 Triple Quard LC/MS，1260型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器(DAD)，美國Agilent公司；UV-2550分光光度計，日本島津公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Millipore Q超純水器，美國Millipore 公司；PH3-3C pH計，上海雷磁儀器廠。

2方法

2.1 蝦紅素的制備

取5g雨生紅球藻油，加入1∶10(W∶V)的7%的KOH-乙醇溶液，在一定溫度下磁力攪拌進行皂化反應。反應一段時間后，將皂化液于4℃環境中靜置過夜，利用冷卻結晶的原理使蝦紅素充分析出，然后經5000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀物，沉淀用10%的HCl-乙醇溶液洗滌4～5次，中和皂化液，之后再用50%的乙醇洗滌4～5次以除去皂化過程中產生的脂肪酸鹽等極性雜質，最后用蒸餾水將沉淀中的鹽等雜質洗去，凍干，即得暗紫色粉末，即為蝦紅素樣品。

2.2 皂化反應條件優化

分別對影響皂化反應程度的堿液濃度、反應時間和反應溫度3個因素，進行單因素實驗，確定最佳皂化工藝。

2.2.1 堿濃度分別配制濃度為3%、5%、7%、9%、11%的KOH-乙醇溶液。取2g雨生紅球藻油，分別加入20mL上述不同濃度的堿液，于15℃下磁力攪拌，反應120min后，取樣，HPLC法檢測蝦紅素轉化率。

式中：SAstacene為蝦紅素在液相譜圖中峰面積；STotal為液相譜圖中總峰面積。

2.2.2 皂化時間取2g雨生紅球藻油，加入20mL 7%的KOH-乙醇溶液，15℃下反應，分別于60、80、100、120、140min取樣，HPLC法檢測蝦紅素轉化率。

2.2.3 溫度取2g雨生紅球藻油，加入20mL 7%的KOH-乙醇溶液，分別于5、15、25、35和45℃下磁力攪拌反應120min，取樣，HPLC法檢測蝦紅素轉化率。

2.3 蝦紅素HPLC分析

樣品前處理：取100μL皂化液，加入1mL二氯甲烷進行萃取，用飽和食鹽水洗滌至中性后，將二氯甲烷萃取液用N2吹干，用1mL甲醇/甲基叔丁基醚(色譜純)(1∶1，V/V)復溶，用0.22μm的有機膜過濾后上樣檢測。

色譜條件[8]：色譜柱為YMC Carotenoid-C30(4.6mm×250mm，S-5μm)；流動相A為甲醇，流動相B為甲基叔丁基醚，流動相C為1%磷酸水溶液。洗脫梯度為：0～15min，88%A，10%B，2%C；15～25min，0%A，100%B，0%C；25～35min，88%A，10%B，2%C。洗脫時間30min；流速1mL/min；進樣體積20μL；柱溫35℃；檢測波長480nm。

2.4 蝦紅素HPLC-(+)APCI-MS/MS分析

將蝦紅素粉末樣品用二氯甲烷溶解后進行液相色譜質譜聯用(LC-MS)分析。液相與蝦紅素標準品進行對照。色譜條件：色譜柱為YMC Carotenoid-C30(4.6mm×250mm，S-5μm)；流動相為100%甲醇，等度洗脫，檢測波長480nm。質譜條件：APCI源，正離子模式；霧化氣40psi；干燥氣流速5L/min，干燥氣溫度350℃，離子源溫度450℃；毛細管電壓4500V，裂解電壓60V，碰撞能量15ev；掃描范圍m/z100～1000。

2.5 蝦紅素純度測定

將蝦紅素標準品用二氯甲烷/甲醇(1∶9，V/V)配成20μg/mL的標準溶液，HPLC法分別進樣5、10、15、20、25μL，以液相峰面積為縱坐標，以蝦紅素質量為橫坐標繪制標準曲線。取1mg蝦紅素樣品用二氯甲烷/甲醇(1∶9，V/V)定容至50mL，HPLC法進樣20μL進行測定。

2.6 蝦紅素光譜特性分析

取少量蝦青素和蝦紅素溶于二甲基亞砜使溶液顏色呈橙黃色，用紫外可見分光光度計掃描溶液最大吸收波長λmax，比較兩者λmax差異。

2.7 蝦紅素穩定性

2.7.1光照條件將少量蝦紅素粉末溶于二甲基亞砜，使初始吸光值介于0.2和0.8之間，并測定初始吸光值。分別在避光、太陽光、室內自然光、燈光和紫外光5種條件下處理，8h后測定其在495nm下的吸光值，計算色素保留率，評價其穩定性。

色素保留率計算公式：

2.7.2 金屬離子將少量蝦紅素粉末溶解于二甲基亞砜，使其在495nm下的初始吸光值介于0.2和0.8之間。取3mL蝦紅素溶液，各加入0.01mol/L的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Na+、Fe3+、Fe2+的硫酸鹽水溶液1mL，室溫避光放置2d后，測定其在495nm下的吸光值，計算色素保留率。

2.7.3 pH配制3%的蝦紅素乙酸乙酯溶液，之后按體積比1∶9加入15%的吐溫水溶液(含7%乙醇，pH=7.0)配成蝦紅素母液，用緩沖液調整其pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，室溫避光放置2d后，測定其吸光值，計算色素保留率。

2.7.4 溫度將少量蝦紅素粉末溶解于二甲基亞砜，使其在495nm下的初始吸光值在0.6左右。測定蝦紅素在15、40、60和80℃下的穩定性，計算色素保留率。

3結果與討論

3.1 蝦紅素制備工藝條件優化研究皂化反應條件優化

前期試驗表明，由于皂化反應是界面反應，皂化在水溶液中進行會導致堿和蝦青素酯接觸不充分降低皂化效率，故皂化助溶劑選取有機溶劑。本實驗采用無毒的乙醇作為溶劑。且比較發現KOH比NaOH的皂化效果更好，所以選擇KOH-乙醇溶液進行雨生紅球藻油的皂化。

皂化過程中堿濃度、皂化時間和溫度對皂化反應的影響如圖2所示。由圖中結果可知，隨著堿濃度的升高，皂化液中蝦紅素含量逐漸增加，后期趨于穩定。由于堿濃度過高會造成后續脫鹽較困難，因此，綜合考慮選擇堿液濃度為7%；皂化過程中，隨反應時間延長，蝦紅素生成量增加，140和120min皂化液中蝦紅素含量相差不大，考慮時間過長可能會導致蝦紅素二次氧化降解，因此，選擇120min作為合適的皂化時間；通過對比反應溫度對蝦紅素生成量的影響發現，4℃下皂化反應速率緩慢，蝦紅素生成量明顯低于其他溫度，15℃下蝦紅素含量最高，當溫度高于15℃時，溫度升高蝦紅素含量反而略有下降，推測溫度升高有可能加快蝦紅素降解，故選擇15℃作為合適的皂化溫度。綜上所述，制備蝦紅素的最佳工藝條件為：堿液濃度7%，反應溫度15℃，反應時間為120min。在此條件下制備蝦紅素，計算蝦紅素得率為62.16%。

圖2　堿濃度、皂化時間和溫度對雨生紅球藻藻油皂化反應的影響

3.2 蝦紅素制備過程表征

采用HPLC法檢測皂化液中蝦紅素在蝦青素類物質中的含量。圖3為皂化前(a)和皂化過程中(b)的HPLC圖。皂化前全部為蝦青素酯，皂化后蝦青素酯降解，產生了游離的蝦青素和蝦紅素，隨反應時間延長，酯全部水解，蝦青素含量逐漸降低，蝦紅素含量逐漸升高。經HPLC-DAD-(APCI)MS/MS分析表明，峰1(保留時間8.634min)為蝦青素([M+H]+597.5)，峰2(保留時間9.565min)為半蝦紅素(分子量[M+H]+595.5)，峰3(保留時間10.718min)為蝦紅素([M+H]+593.3)。

3.3 LC-MS/MS結果

蝦紅素粉末與標準品液相對照結果(見圖4)表明所得粉末成分主要為蝦紅素。結合文獻[3]，由皂化液純化后得到的粉末MS譜圖分析蝦紅素裂解規律如圖5所示。m/z593.4為蝦紅素質子化的分子離子峰，m/z575.5為[M+H-H2O]+，即蝦紅素分子失去一分子水所產生的碎片離子峰，為蝦紅素骨架的特征碎片離子，因此推斷粉末成分為蝦紅素。根據蝦紅素的二級質譜圖分析其裂解規律，發現蝦紅素的裂解易發生在共軛不飽和雙鍵的長鏈上，分析其特征碎片可以為研究其降解機理提供理論基礎。

圖3　雨生紅球藻藻油皂化前(a)和皂化過程中(b)HPLC-DAD圖譜及峰1、2和3的質譜圖

圖4　蝦紅素標準品(a)和樣品(b)HPLC圖譜

圖5　樣品二級質譜圖及蝦紅素裂解規律

3.4 蝦紅素純度

繪制的蝦紅素標準曲線方程為y=4.000 9x-20.700，且R2=1.000 0，經計算，制得的樣品中蝦紅素純度為80.36%。

3.5 蝦紅素光譜特性

光譜掃描結果(見圖6)顯示蝦青素的最大吸收波長為480nm左右，蝦紅素最大吸收波長為495nm，表明蝦紅素增加2個雙鍵后吸收光譜發生了紅移，所以蝦紅素比蝦青素在溶劑中顏色更為鮮艷。

圖6　蝦青素和蝦紅素光譜掃描結果

3.6 穩定性

3.6.1光照條件由圖7(a)比較不同光源照射8h后蝦紅素的穩定性。紫外光對蝦紅素破壞最嚴重，在連續照射8h后蝦紅素完全變為無色。日光對蝦紅素也有一定的破壞作用，原因可能是日光中有一定紫外線。而自然光和燈光相對較柔和，因此自然光、燈光和避光條件對蝦紅素影響較小。與其他類胡蘿卜素相似，蝦紅素對光的敏感性歸結于其分子內部不飽和雙鍵等特殊結構在光作用下自身的氧化分解，從而導致雙鍵消失，使得吸收光譜發生變化，吸收波長不再出現于可見區域，色澤消褪[9-11]。所以蝦紅素要盡量避光保存，蝦紅素著色的食品在運輸和儲藏過程中也要注意避光以保證其品質。

3.6.2 金屬離子在色素的提取加工及應用的過程中往往要接觸到金屬離子，研究色素在金屬離子存在條件下的穩定性對加工應用而言是很有參考價值的。如圖7(b)所示，Fe3+存在時蝦紅素損失最嚴重，保留率僅為19.47%，其次是Ca2+、Cu2+，而Mg2+、Zn2+、Na+和Fe2+對蝦紅素影響不大。宋素梅等[12]研究結果表明，Cu2+、Fe2+和Fe3+對南極磷蝦蝦殼中的蝦青素破壞最為嚴重，其中Fe3+對蝦青素的影響最大，對蝦紅素而言，同樣是Fe3+對其穩定性影響最大，猜測可能是與Fe3+氧化能力有關。因此在蝦紅素制取和應用過程中要盡量避免使用鐵器。

圖7　光照(a)、金屬離子(b)、pH(c)和溫度(d)對蝦紅素穩定性的影響

3.6.3 pH考慮到蝦紅素在食品中的應用，測定其在pH為3～8范圍內的穩定性。圖7(c)表明，蝦紅素在pH為3～8范圍內，隨pH升高，蝦紅素保留率提高，故弱堿性有利于蝦紅素的穩定，而過酸則會對蝦紅素產生破壞作用。

3.6.4 溫度由圖7(d)可知，在溫度為15 和40℃時蝦紅素較為穩定，加熱60min時吸光值分別下降了1.89%和4.04%。而60和80℃時蝦紅素會產生降解，吸光值下降7.77%和38.20%。表明蝦紅素對溫度具有一定的穩定性，在較低溫度下穩定性較好，溫度越高，蝦紅素越不穩定，越容易發生降解從而褪色，影響其著色效果。所以蝦紅素的保存和使用要避免高溫。

4結語

本文創新性地以雨生紅球藻為原料，采用皂化法和溶劑分配法分離制備高純度蝦紅素，確定了最佳皂化工藝:堿液濃度為7%，皂化時間為120min，溫度為15℃，并采用酸洗、醇洗和水洗的方法純化出蝦紅素。此方法較合成法操作更為簡便，且能夠得到較高純度的蝦紅素，適合工業化生產。采用HPLC-DAD-MS/MS方法對純化后粉末進行分析，確定蝦紅素結構及裂解規律。另外，本文系統研究了蝦紅素的穩定性，考察了光照條件、金屬離子、pH和溫度對其穩定性的影響。發現紫外光對蝦紅素的破壞作用最強，其次是太陽光，燈光和室內自然光在考察期內對蝦紅素無明顯影響；Fe3+存在時蝦紅素損失嚴重，Ca2+、Cu2+有一定破壞作用；弱堿性條件有利于蝦紅素的穩定；在較高溫度(80℃)下蝦紅素會產生降解。上述研究結果可以為蝦紅素生物活性研究及其應用奠定基礎。

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責任編輯朱寶象

Preparation of Astacene fromHaematococcuspluvislisand Analysis of its Stability

LI Xue-Min, ZHOU Qing-Xin, XU Jie, YANG Lu, YANG Shu, ZHANG Ting, XUE Chang-Hu

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：Astacene is a kind of carotenoid which can be used as colorant and antioxidant. Its structure is similar to astaxanthin. While astaxanthin has been studied for years, no much attention has been paid on astacene. The purpose of this study is to prepare astacene from Haematococcus pluvislis extract and to study some properties of it. In this study, Haematococcus pluvislis extract was used as the raw material of preparing purifying astacene with saponification method and solvent distribution method with its structure and stability determined. In terms of the saponification condition, alkali concentration, reaction time and reaction temperature were optimized. The optimal condition was as follows: the concentration of alkali was 7%, saponification time was 120 min, and the temperature was 15 ℃. After saponification under this condition, the saponification solution was placed under 4 ℃ overnight to make astacene precipitate as much as possible. Then the solution was centrifuged and the sediment was washed with HCl-ethonal solution(v/v, 1∶9)and 50% ethonal for 4～5 times to remove alkali and impurities. At last, the sediment was freeze-dried and astacene was obtained. The conversion rate of astacene was up to 96.12% with a 62.16% yield of astacene. The purity of the sample was 80.36%. The product was analyzed by HPLC-DAD-(APCI)MS/MS, and the MS decomposition rule of astacene was parsed. It was found that astacene mainly lost water and ruptured on its conjugated double bonds in MS/MS. Finally, the effects of light conditions, metal ions, pH and temperature on astacene stability were studied. The results showed that ultraviolet had the strongest damaging effect on astacene. Fe3+, Ca2+and Cu2+caused damage to astacne at different degrees, while Zn2+, Mg2+, Na+and Fe2+had little effect on it. Acidity between pH 3 and 8, the stability of astacene increased with pH. With the increase of temperature, retention rate of astacene decreased. This study provided a reference for the research of astacene in terms of its activity, toxicology and application in food.

Key words:Haematococcus pluvislis; astacene; HPLC-MS; stability

中圖法分類號：TS254.9

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)01-049-07

作者簡介：李學敏(1991-)，女，碩士。E-mail: haidalixuemin@163.com

收稿日期：2014-12-18；

修訂日期：2015-05-03

*基金項目：國家自然科學基金項目(U1406402;31571864)；“泰山學者”建設工程專項經費項目資助

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20140415

引用格式：李學敏， 周慶新， 徐杰， 等. 雨生紅球藻蝦紅素的制備及其穩定性研究[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版)， 2016， 46(1)： 49-55.

LI Xue-Min, ZHOU Qing-Xin, XU Jie, et al.An integrative evaluation of ecological effect of artificial reefs with entropy-weighted fuzzy matter-element method[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(1): 49-55.

Supported by National Natural Science Foundation of China(U1406402;31571864)； Special Financial Fund of Taishan Scholars Construction Program

**通訊作者： E-mail: xuech@ouc.edu.cn