畢赤酵母異源表達β-葡聚糖酶酶學特性的研究

王苑螈，王 波，王秀英，申 強，薛 永，李大偉，彭日荷，姚泉洪*

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106；3上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；4無錫市農業技術推廣總站，無錫214023）

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畢赤酵母異源表達β-葡聚糖酶酶學特性的研究

王苑螈1，2，王 波2*，王秀英2，3，申 強4，薛 永2，李大偉1，2，彭日荷2，姚泉洪2**

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106；3上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；4無錫市農業技術推廣總站，無錫214023）

摘 要：根據酵母密碼子的偏好性對來自某異源菌種的葡聚糖酶基因進行化學合成改造，用電轉化方法整合到畢赤酵母基因組中進行表達，并對表達出的內切β-葡聚糖酶進行相關酶學特性研究。結果表明：酶的最適pH為4" 5，最適溫度為40℃；酶的pH穩定性范圍與緩沖溶液類型有關，為4" 0—6" 0；Al3＋對酶有激活作用，但Mn2＋和Cu2＋則會抑制酶的活性；此酶對羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）有較強的分解能力；胃蛋白酶對該酶有抑制作用。

關鍵詞：β-葡聚糖酶；畢赤酵母；酶學特性；DNS法

β-葡聚糖是一種自然合成多糖，在細胞壁中屬于非淀粉性結構多糖，是一種由β-1，3和β-1，4糖苷鍵鏈接的D-葡萄糖聚合物［1］。β-葡聚糖酶是一類能夠降解葡萄糖聚合物的酶系，大部分由微生物產生，如細菌（芽孢桿菌屬）、真菌（曲霉屬、毛霉屬、木霉屬等）和瘤胃微生物，同時也存在于谷物中［2-4］。β-葡聚糖酶屬于糖基水解酶，根據其作用方式可分為內切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 73）、內切-β-1，3-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 39）、外切-β-1，3-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 58）和外切-β-1，4-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 74），隨機水解β-1，3或β-1，4糖苷鍵，生成葡萄糖和寡糖［5-6］。

植物種子可以產生β-葡聚糖酶，在萌發過程中分解胚乳細胞壁中的β-葡聚糖，解除其對營養成分的抑制作用，促進種子正常萌發［7］。β-葡聚糖酶還是一種綠色飼料添加劑，它可以降低腸胃內容物的黏度，改善單胃動物對營養物質的吸收，提高飼料利用率［8-9］。在釀造工業中，啤酒過濾、啤酒非生物沉淀等問題都可以通過添加β-葡聚糖酶得到解決［10-11］。另外，β-葡聚糖酶在植物抗真菌基因工程中也有所研究。β-葡聚糖酶廣泛應用在醫藥、紡織、日化、廢水處理等行業，前景可觀［12-13］。

玉蜀黍赤霉菌無性型又稱為禾谷鐮刀菌，是一種植物病原體，能夠引起小麥、大麥的赤霉病和玉米的穗腐病，造成農作物品質降低和產量嚴重減少，引起糧食問題［14］。目前國內外對來自玉蜀黍赤霉菌的葡聚糖酶研究甚少，本試驗重新改造合成來自玉蜀黍赤霉菌的葡聚糖酶基因，并利用電轉化法將其導入到畢赤酵母細胞中，對表達出的β-葡聚糖酶進行相關酶學特性研究。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

所用藥品均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

電轉儀購自Bio-Rad公司；多功能酶標儀購自TECAN infinite M200瑞士帝肯公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海醫用恒溫設備廠。

1．2 方法

1" 2" 1 酶促反應體系

酶促反應的基本體系為280 μL，包括70 μL粗酶液、70 μL Na2HPO4-檸檬酸緩沖（pH 5" 0）、140 μL 1％的CMC-Na（溶于100 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 4" 5），40℃反應60 min；反應結束后，加入等體積（280 μL）DNS試劑，100℃反應10 min顯色，冷卻后在550 nm下測定OD值；每組設1個空白對照和3個平行，在允許誤差內數據用平均值呈現。

1" 2" 2 葡萄糖標準曲線的繪制

配制質量分數為2％的葡萄糖母液（稱取2 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水），分別稀釋成0" 01％、0" 02％、0" 04％、0" 06％、0" 08％、0" 1％、0" 12％、0" 14％8個梯度。每個梯度做1個對照和3個平行（以失活酶作為空白對照），依次加入70 μL葡萄糖溶液、70 μL粗酶液、140 μL緩沖液（Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 4"5），直接加入等體積（280 μL）DNS試劑反應顯色，冷卻后于550 nm下測定OD值，繪制標準曲線。

1．3 玉蜀黍赤霉菌β-1，4-葡聚糖酶純化后的酶學特性研究

1" 3" 1 反應的最適溫度和最適pH

調節恒溫水浴鍋，在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、pH 5" 0下反應60 min，根據DNS法測定其550 nm吸光值。

配制不同pH（2" 2、3" 0、4" 0、5" 0、6" 0、7" 0、8" 0）的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，用來溶解反應底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），于最適溫度（40℃）下反應。

1" 3" 2 熱穩定性的研究

將酶液分為7組，分別于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃預處理60 min；每隔10 min取樣一次，置于4℃冰箱中，待樣品完全處理后加入CMC-Na于最適條件下（40℃，pH 4" 5）進行酶活反應，以未處理組（0 min，40℃）活力值為100。

1" 3" 3 pH穩定性的研究

將酶液與不同pH的緩沖液混合，于4℃條件下放置24 h，取出后進行正常的酶活反應；對照組則不經過低溫、緩沖液處理，直接于不同pH下反應。

1" 3" 4 不同金屬離子對酶活力的影響

分別配置不同濃度的金屬離子（Na＋、Al3＋、Li＋、Ca2＋、Cr3＋、K＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Mn2＋、Pb2＋和Fe3＋）溶液，使其在反應體系中的最終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L，加入等體積（70 μL）酶液于40℃下處理30 min；對照組不添加任何金屬離子，以其活力值為100，在最適條件下反應。

1" 3" 5 消化酶對酶活力的影響

分別將胃蛋白酶（用pH 2" 2的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配置，終濃度為50 U/mL）和胰蛋白酶（用pH 7" 0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，終濃度為50 U/mL）與酶液混合，在最適條件下分別反應1 h和2 h，測定酶活力。

1" 3" 6 底物專一性

另選取3種不同的反應底物微晶纖維素、濾紙、脫脂棉，分別稱取8 mg（±0" 1 mg），溶于pH 4" 5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，與酶液在40℃下分別反應1 h、2 h、3 h，觀察其分解結果，測定550 nm吸光值。

2 結果與分析

2．1 最適溫度和熱穩定性

由圖1可以看出，β-葡聚糖酶適合反應的溫度范圍為30—50℃，最大酶活力在40℃左右，反應曲線呈拋物線型；以未處理的酶樣為對照（40℃），計算不同溫度下的相對酶活力。由圖2可知，酶在最適溫度40℃以下活力穩定，在很小范圍內波動；當溫度不斷升高時，活力開始緩慢下降（50℃）；當溫度達到60℃、70℃或更高時，處理10 min后酶即快速失活為0，說明此酶不是耐高溫酶。

圖1　β-葡聚糖酶的最適反應溫度Fig．1 The optimal temperature of β-1，4-glucanase

圖2　β-葡聚糖酶的熱穩定性Fig．2 The thermostability of β-1，4-glucanase

2．2 最適pH和pH穩定性

在不同pH下測定的酶活力顯示，β-葡聚糖酶的最適pH在4" 5左右，在pH 3" 0—7" 0時，酶活相對值高于70％。經過24 h、4℃處理后，此酶的穩定性較好，穩定值在pH 4" 0—6" 0；當pH＜2" 5或＞7" 5時，酶活力較低（圖3）。

圖3　β-葡聚糖酶的最適pH和pH穩定性Fig．3 The optimal pH and pH stability of β-1，4-glucanase

2．3 金屬離子對酶活力的影響

研究了高濃度（10 mmol/L）和低濃度（1 mmol/L）金屬離子對酶活的影響，結果表明：不管是在高濃度還是低濃度下，Mn2＋對酶活力均有一定的抑制作用，相對酶活低濃度為69" 4％，高濃度為79" 1％；高濃度的Cu2＋對酶活力有相當強的抑制作用，相對酶活為49" 5％；高濃度的Al3＋對酶活力有一定的促進作用，相對酶活為142" 8％（圖4）。

圖4　不同濃度金屬離子對β-葡聚糖酶的影響Fig．4 Effects of different concentrations of mental ions on β-1，4-glucanase

2．4 消化酶對酶活的影響

從表1可以看出，胃蛋白酶對此酶有一定程度的抑制作用；而胰蛋白酶則對酶活無明顯影響；生產中作為動物飼料添加劑時，需考慮消化酶的相互作用。

表1　胃蛋白酶和胰蛋白酶對β-葡聚糖酶活性的影響Table 1 Effects of pepsin and trypsin on β-1，4-glucanase

2．5 酶的底物專一性

由表2可以看出，此酶的底物專一性較好，只對羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等纖維素類物質有較強的分解作用，對微晶纖維素、濾紙、脫脂棉等的分解能力微弱。

表2　β-葡聚糖酶的底物專一性Table 2 The substrate specificity of β-1，4-glucanase

3 討論

本研究表明，β-1，4-葡聚糖酶的最適pH為4" 5，最適溫度為40℃，是一種常規酶［15-17］，偏酸性；其最適溫度與動物腸道內環境溫度十分相似，可以更好地促進葡聚糖分解為寡糖，利于消化和吸收，是綠色動物飼料添加劑的新選擇。在工業應用中，酶與各種金屬離子的相互作用應予以考慮。鑒于Al3＋對該酶具有一定的促進作用，可以考慮適當添加；而Mn2＋和Cu2＋則需避免或少量添加，并且考慮到生化反應中Mn2＋和Cu2＋的出現及其相互作用，應做到抑制作用最小化。不同的金屬離子對不同的葡聚糖酶的影響也不盡相同，也許是因為酶的基因來源不同導致金屬離子與葡聚糖酶內電子轉運系統的相互作用能力不同。目前，其具體的作用機制還不是非常清楚，有待于進一步探究［18-19］。該酶對羧甲基纖維素鈉具有很強的分解作用，且該酶的專一性較強。羧甲基纖維素鈉為當今世界上使用范圍最廣、用量最大的纖維素種類，本研究所得到的玉蜀黍赤霉菌β-1，4-葡聚糖酶的相關酶學特性數據，將為其實際應用提供重要借鑒和參考。

參 考 文 獻

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（責任編輯：閆其濤）

Characterization of endo-β-1，4-glucanase heterologously expressed in Pichia pastoris

WANG Yuan-yuan1，2，WANG Bo2*，WANG Xiu-ying2，3，SHEN Qiang4，XUE Yong2，LI Da-wei1，2，PENG Ri-he2，YAO Quan-hong2**
（1College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Agro-Biotechnology Research Center，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University Shanghai 200234，China；4Wuxi City Agricultural Technology Extension Station，Wuxi 214023，China）

Abstract：The β-1，4-glucanase gene from Gibberella zeae was re-synthesized chemically according to the yeast bias condon and tansformed into Pichia pastoris by electroporation" The expressed endo-β-glucanase was characterized，and the results showed that the optimal pH is 4" 5 and the optimal temperature is 45℃" The pH stability of the enzyme was 4" 0—6" 0，which was related to the type of buffer solution" Al3＋had activation on the enzyme，but Mn2＋and Cu2＋inhibited the enzyme activity" The substrate specificity on carboxylmethyl cellulose sodium salt（CMC-Na）was strong" Pepsin had an inhibiting effect on the enzyme"

Key words：β-glucanase；Pichia pastosis；Enzymatic characteristics；DNS method

作者簡介：王苑螈（1989—），女，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail：yuanyuanw29＠163" com；Tel：18674383752*共同第一作者

基金項目：上海市農委重大項目（滬農科種字2013-8、滬農科種字2014-2）

收稿日期：2015-01-04

文章編號：1000-3924（2016）01-010-05

中圖分類號：S816" 3

文獻標識碼：A

**通信作者：姚泉洪（1965—），男，博士，研究員，研究方向：植物和微生物基因工程。E-mail：yao" quanhong65＠yahoo" com