高產(chǎn)洛蒙真菌素的洛蒙德鏈霉菌S015的誘變篩選

張春曉，錢 瑋，王 威，胡洪波，彭華松，張雪洪

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海200240）

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高產(chǎn)洛蒙真菌素的洛蒙德鏈霉菌S015的誘變篩選

張春曉，錢 瑋，王 威*，胡洪波，彭華松，張雪洪

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海200240）

摘 要：通過洛蒙真菌素的結(jié)構(gòu)類似物吩嗪-1-羧酸（Phenzine-1-catboxylic acid，PCA）對1株洛蒙真菌素的產(chǎn)生菌——洛蒙德鏈霉菌野生菌株S015誘變，篩選到突變株S015-P34，其洛蒙真菌素的產(chǎn)量達(dá)到了（106" 0± 4" 4）mg/L，是野生株的3" 2倍；通過作用于核糖體的抗生素利福平和慶大霉素分別對菌株S015誘變，篩選到突變株S015-R6和S015-G11，洛蒙真菌素的產(chǎn)量分別達(dá)到了（103" 4±0" 1）mg/L和（81" 2±2" 5）mg/L，是野生株的3" 2倍和2" 5倍；最后，結(jié)合PCA和利福平的復(fù)合抗性篩選，得到突變株S015-R6-46，洛蒙真菌素的產(chǎn)量為（168" 0±2" 2）mg/L，是野生型菌株的5" 1倍；又通過添加0" 1 mmol/L FeCl3發(fā)酵培養(yǎng)，使突變株S015-R6-46的洛蒙真菌素產(chǎn)量達(dá)到（258" 7±5" 7）mg/L。這試驗結(jié)果可為其他產(chǎn)吩嗪類活性物質(zhì)的鏈霉菌的高產(chǎn)菌株的誘變篩選提供參考。

關(guān)鍵詞：洛蒙德鏈霉菌；誘變；篩選；洛蒙真菌素；吩嗪類化合物

吩嗪類化合物是一類含氮雜環(huán)化合物，易溶于乙醚、苯等，幾乎不溶于水［1］。天然吩嗪類化合物主要存在于假單胞菌和鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中［2-5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種天然吩嗪類化合物，幾乎對細(xì)菌和真菌都有抑菌活性［6-7］，例如，熒光假單胞菌產(chǎn)生的吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-carboxylic，PCA），以其為主要成分研發(fā)的新型微生物源農(nóng)藥，2011年獲得農(nóng)藥登記證（PD20110315F130），能夠有效防治水稻紋枯病、小麥根部腐蝕的小麥全蝕病、西瓜枯萎病等［8-10］。銅綠假單胞菌合成的吩嗪-1-甲酰胺（Phenaizne-1-carboximade，PCN）則對西紅柿枯萎病等病原菌有顯著的抑制作用［11］。某些天然吩嗪類化合物還具有抗腫瘤、抗瘧疾、抗寄生蟲等功效［2］，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注與研究。

由于天然吩嗪類化合物在野生菌株中的產(chǎn)量普遍較低，限制了其應(yīng)用。因此，篩選高產(chǎn)菌株、提高吩嗪類化合物的產(chǎn)量是目前天然吩嗪類化合物研究的熱點(diǎn)之一。菌種的誘變選育是篩選高產(chǎn)菌株的簡單實(shí)用的方法之一［12］。除了常用的物理誘變和化學(xué)誘變，用具有特定作用靶點(diǎn)的抗生素作為誘變劑進(jìn)行誘變育種，通常能得到更多的正向突變菌株。Ochi等的研究發(fā)現(xiàn)，鳥苷四磷酸（ppGpp）對抗生素合成起著重要作用：破壞ppGpp的合成基因（relA），使ppGpp無法積累時，抗生素的合成量也會減少［13-17］。利福平、慶大霉素等抗生素，都能模擬ppGpp的作用，Lai等［18］發(fā)現(xiàn)利福平的抗性突變能夠提高變鉛青鏈霉菌次級代謝物的產(chǎn)量。微生物通過反饋抑制和反饋?zhàn)瓒粝拗拼x產(chǎn)物的過量積累，通過篩選抗高濃度自身代謝終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物的抗反饋或抗阻遏突變型，也是獲得高產(chǎn)突變菌株的一種有效途徑［19］。

洛蒙真菌素（Lomofungin）是一種酸性的橄欖黃色吩嗪類化合物［20］，天然的洛蒙真菌素是由美國Upjohn公司的Bergy博士等人首次在洛蒙德鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中純化得到［21］。洛蒙真菌素可以抑制金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌及終極腐霉、油菜菌核病原菌、酵母菌、星形諾卡氏菌等多種真菌的菌體生長［20，22-23］，是極具潛力的具有殺菌功能的生防制劑。洛蒙德鏈霉菌S015是本實(shí)驗室從上海周邊土壤中篩選到的一株可生物合成洛蒙真菌素的活性鏈霉菌，前期工作已對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化［24］。為了進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，本研究通過洛蒙真菌素的結(jié)構(gòu)類似物PCA的抗性誘變，結(jié)合能模擬ppGpp作用的抗生素（利福平，慶大霉素）的抗性誘變，篩選洛蒙真菌素菌株的高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1" 1" 1 菌株 菌株：洛蒙德鏈霉菌S015（Streptomyces lomondensis S015，CCTCC No：M2013140），由本實(shí)驗室保存。

1" 1" 2 培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基：黃豆餅粉30 g，溶于1 L水，煮沸后用紗布過濾，將濾過的液體再次定容至1 L，甘露醇20 g，瓊脂20 g（固體用），121℃，20 min高溫滅菌。

YM培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，麥芽提取物10 g，酵母提取物4 g，溶于1 L蒸餾水中，調(diào)pH至7" 3，115℃，20 min高溫滅菌。

1" 1" 3 試劑 60％甘油（體積濃度）：甘油60 mL，加水混勻，定容到100 mL，121℃，20 min高溫滅菌；PCA：本實(shí)驗室保存；硫酸慶大霉素：生工生物；利福平：生工生物；鹽酸，丁酮：分析純，上海國藥集團(tuán)；甲酸，乙腈：HPLC色譜純，上海國藥集團(tuán)。

1" 1" 4 儀器 THZ-C恒溫振蕩器培養(yǎng)箱：江蘇太倉市實(shí)驗設(shè)備廠；Centrifuge 5804R型以及Centrifuge Mini Spin型高速離心機(jī)：Eppendorf美國；1260型高效液相色譜：Agilent美國；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9080）：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；SHENSHENG旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝生物技術(shù)有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-SⅡ）：上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；精密天平（PL2001，EL104）：美國Mettlor Toledo。

1．2 試驗方法

1" 2" 1 菌種培養(yǎng) 菌株種子培養(yǎng)參見［20］。搖瓶發(fā)酵：取面積約1 cm2的平板孢子，直接接種至含有50 mL/250 mL YM發(fā)酵培養(yǎng)基中。180 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)。

1" 2" 2 細(xì)胞干重和洛蒙真菌素產(chǎn)量測定 取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，沉淀用水洗后放置60℃烘箱中，烘至恒重后用精密電子天平測干重。

上清液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH到2" 0，加入5 mL丁酮，振蕩萃取3—5 min后，于12 000 r/min離心5 min。取上層有機(jī)相，用真空旋轉(zhuǎn)干燥儀于33℃蒸干丁酮。樣品溶于5 mL比例為1∶1的乙腈、0" 1％甲酸水溶液，0" 45 μm的微孔濾膜過濾后，用于測定洛蒙真菌素的產(chǎn)量。

洛蒙真菌素的HPLC檢測方法：以0" 1％甲酸水（A）和乙腈（B）做流動相，1—4 min，A∶B＝8∶2；4—20 min，A∶B＝6∶4；20—30 min，A∶B＝8∶2。流速為1 mL/min；檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣20 μL。柱子型號：Agilent Eclipse Plus C18 column，250 mm×4" 6 mm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制質(zhì)量濃度分別為10 g/mL、20 g/mL、30 g/mL、50 g/mL、75 g/mL、100 g/mL、150 g/mL的樣品進(jìn)行HPLC檢測，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1" 2" 3 PCA耐受性篩選 制備單孢子懸浮液：取28℃培養(yǎng)6—7 d的新鮮菌株平板，用滅過菌的棉簽將孢子刮下，將其加入10 mL無菌水，采用經(jīng)過滅菌的脫脂棉過濾后，重新定容至10 mL孢子懸液。充分振蕩使孢子分散成單孢子懸液。用無菌水按10－1梯度稀釋至孢子量濃度約為104個/mL，備用。

添加外源PCA：將適量PCA溶于滅過菌的蒸餾水中，過濾除菌，添加至孢子懸液中，并形成PCA終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的孢子懸液，于4℃冰箱過夜處理。將過夜處理后的添加不同質(zhì)量濃度PCA的孢子懸浮液，100 μL涂布于相同PCA質(zhì)量濃度的黃豆餅粉（MS）固體培養(yǎng)基平板上，待其生長3—4 d后，觀察其生長情況。

搖瓶發(fā)酵復(fù)篩：配制50 mL YM發(fā)酵培養(yǎng)基（每瓶添加10 g玻璃珠以打散菌體），取添加PCA固體培養(yǎng)基平板上的單菌落，至復(fù)篩搖瓶中經(jīng)液體種子培48 h后液體發(fā)酵培養(yǎng)，96 h后檢測洛蒙真菌素的產(chǎn)量。

1" 2" 4 抗生素抗性篩選 最小抑菌質(zhì)量濃度確定：將制備的孢子懸液100 μL分別涂布于利福平終濃度為0" 5 μg/mL、1" 0 μg/mL、1" 5 μg/mL、2" 0 μg/mL、2" 5 μg/mL及慶大霉素終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的MS培養(yǎng)基上，觀察出發(fā)菌株對利福平及慶大霉素的敏感性，確定兩種抗生素對洛蒙德鏈霉菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC，Minimum inhibitory concentration最小抑菌濃度）。在兩種抗生素的MIC下篩選抑菌活性提高的抗性菌株。

抗性篩選：將適量利福平及慶大霉素分別溶于無菌蒸餾水中，過濾除菌。添加至制備好的孢子懸浮液中，并形成利福平終濃度為0" 5 μg/mL、1" 0 μg/mL的孢子懸浮液，以及慶大霉素終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的孢子懸浮液，于4℃冰箱過夜處理。將過夜處理后的添加不同質(zhì)量濃度抗生素的孢子懸液100 μL分別涂布于相同抗生素質(zhì)量濃度的黃豆餅粉（MS）固體培養(yǎng)基平板上，待其生長3—4 d后，觀察其生長情況。

搖瓶發(fā)酵復(fù)篩：配制50 mL YM發(fā)酵培養(yǎng)基（每瓶添加10 g玻璃珠以打散菌體），取慶大霉素以及利福平平板的單菌落，至復(fù)篩搖瓶中經(jīng)液體種子培養(yǎng)48 h后液體發(fā)酵培養(yǎng)，96 h后檢測洛蒙真菌素的產(chǎn)量。

1" 2" 5 復(fù)合條件的抗性篩選 將PCA處理后的高產(chǎn)菌株在黃豆餅粉培養(yǎng)基上劃線傳代，穩(wěn)定地遺傳五代后，將孢子以1" 2" 3方法收集，采用1" 2" 4方法使用利福平進(jìn)行復(fù)合篩選。

將利福平處理后的高產(chǎn)菌株在黃豆餅粉培養(yǎng)基上劃線傳代，穩(wěn)定地遺傳五代后，將孢子以1" 2" 3方法收集，采用1" 2" 3方法使用PCA進(jìn)行復(fù)合篩選。

1" 2" 6 FeCl3發(fā)酵優(yōu)化復(fù)合篩選菌株 將復(fù)合篩選后的高產(chǎn)菌株接種至添加含有0" 01 mmol/L、0" 1 mmol/L、0" 5 mmol/L FeCl3YM發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，96 h檢測洛蒙真菌素的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2．1 結(jié)構(gòu)類似物PCA的耐受性篩選

分別用終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的PCA固體培養(yǎng)基平板對野生株S015進(jìn)行耐受性篩選，固體培養(yǎng)4 d后，經(jīng)過菌落計數(shù)，得到菌株的致死率如表1所示。

表1　PCA質(zhì)量濃度對菌株S015致死率的影響Table 1 Effect of PCA concentration on lethality of strain S015

在PCA質(zhì)量濃度為50 μg/mL和100 μg/mL的平板上，各獲得約100個單菌落。分別挑取各單菌落發(fā)酵并測定洛蒙真菌素的產(chǎn)量，其中產(chǎn)量最高的三株菌株（S015-P02、S015-P14和S015-P34）發(fā)酵培養(yǎng)96 h后菌株的細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成情況見圖1。從圖1可以看出，誘變處理后單菌落發(fā)酵時的菌株生長與野生株有明顯區(qū)別，培養(yǎng)96 h后細(xì)胞干重約為4 g/L；但洛蒙真菌素的合成有顯著變化，其中突變株S015-P34（100 mg/L PCA誘變）發(fā)酵96 h后洛蒙真菌素的產(chǎn)量最高，達(dá)到了（106" 0±4" 4）mg/L，比野生株的產(chǎn)量提高了約3倍。

圖1　PCA誘變對洛蒙德鏈霉菌S015細(xì)胞生長和洛蒙真菌素合成的影響Fig．1 Effects of PCA on strain S015 and its mutants’cell growth and lomofungin yields

2．2 抗生素對菌株的抗性篩選

用終濃度分別為0" 5 μg/mL、1" 0 μg/mL、1"5 μg/mL、2"0 μg/mL和2"5 μg/mL的利福平和終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和60 μg/mL的慶大霉素對野生株S015進(jìn)行抗性篩選，固體培養(yǎng)4 d后，經(jīng)過菌落計數(shù)，得到菌株的致死率如表2所示。

根據(jù)表2結(jié)果，在利福平質(zhì)量濃度為0" 5 μg/mL和1" 0 μg/mL的平板上，各獲得約120個單菌落。分別挑取各單菌落發(fā)酵并測定洛蒙真菌素的產(chǎn)量，其中產(chǎn)量最高的3株菌株（S015-R6，S015-R19，S015-R28）發(fā)酵培養(yǎng)96 h后菌株的細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成情況見圖2。誘變處理后的菌株生長與野生株沒有明顯區(qū)別，但洛蒙真菌素的合成有顯著變化，從圖2可以看出，其中突變株S015-R6（1" 0 μg/mL利福平）發(fā)酵96 h后洛蒙真菌素的產(chǎn)量最高，達(dá)到了（103" 4±0" 1）mg/L，比野生株的產(chǎn)量提高了約3倍。同樣，在慶大霉素質(zhì)量濃度為20 μg/mL和50 μg/mL也各獲得約100個單菌落。挑取各單菌落發(fā)酵96 h，產(chǎn)量最高的3株菌株（編號為S015-G11，S015-G36，S015-G58）的生長沒有明顯變化，洛蒙真菌素的最高產(chǎn)量達(dá)到（81" 2±2" 6）mg/L（S015-G11），比野生株的產(chǎn)量提高了約2倍（圖3）。

表2　抗生素質(zhì)量濃度對洛蒙德鏈霉菌致死率的影響Table 2 Effect of antibiotic concentration on lethality of strain S015

圖2　利福平誘變對洛蒙德鏈霉菌細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的影響Fig．2 Effects of rifampicin on strain S015 and its mutants’cell growth and lomofungin yields

圖3　慶大霉素誘變對洛蒙德鏈霉菌細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的影響Fig．3 Effects of gentamicin on strain S015 and its mutants’cell growth and lomofungin yields

2．3 復(fù)合條件對菌株的復(fù)合誘變

由于PCA和抗生素的誘變機(jī)理不同，為了進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)物合成能力，對菌株進(jìn)行了PCA和抗生素（利福平）的復(fù)合誘變，結(jié)果見圖4。用1" 0 μg/mL的利福平對PCA誘變后的高產(chǎn)株S015-P34進(jìn)行進(jìn)一步的誘變處理，對得到的96株單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中菌株S015-P34-61發(fā)酵中洛蒙真菌素的產(chǎn)量最高，為（141" 4±5" 8）mg/L，是S015-P34的1" 5倍。用100 μg/mL的PCA對利福平誘變后的高產(chǎn)株S015-R6進(jìn)行進(jìn)一步的誘變處理，對得到的103株單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中菌株S015-R6-46發(fā)酵中洛蒙真菌素的產(chǎn)量最高，為（168" 0±2" 2）mg/L，是S015-R6的1" 7倍。

2．4 FeCl3發(fā)酵優(yōu)化復(fù)合篩選菌株

通過添加不同離子量濃度的FeCl3對野生菌S015和復(fù)合篩選后的突變菌株S015-R6-46進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，結(jié)果見圖5。與野生株相同［20］，對突變株S015-R6-46添加0" 1 mmol/L的FeCl3培養(yǎng)96 h，洛蒙真菌素的產(chǎn)量最高，為（258" 7±5" 7）mg/L，是未添加的1" 5倍。

圖4　復(fù)合篩選對洛蒙德鏈霉菌細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的影響Fig．4 Effects of compound screening on strain S015 and its mutants’cell growth and lomofungin yields

圖5　FeCl3量濃度對復(fù)合篩選后突變菌株中洛蒙德鏈霉菌細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的影響Fig．5 Effects of FeCl3concentration on strain S015 and its mutants’cell growth and lomofungin yields

前期的工作中，通過改變添加離子的種類和濃度，已經(jīng)對野生株S015進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化［20］。本研究的結(jié)果顯示，在突變株S015-R6-46的培養(yǎng)基中添加FeCl3，同樣可以提高洛蒙真菌素的產(chǎn)量，最佳的FeCl3添加量為0" 1 mmol/L，突變株S015-R6-46的產(chǎn)量達(dá)到了（258" 7±5" 7）mg/L。

3 討論

本試驗主要進(jìn)行了PCA以及抗生素對洛蒙德鏈霉菌的抗性篩選，試驗驗證洛蒙德鏈霉菌S015在添加外源PCA或者利福平以及慶大霉素誘變后，洛蒙真菌素的產(chǎn)量均有不同程度的提高。

根據(jù)鏈霉菌的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)理論，通過對洛蒙真菌素產(chǎn)生菌洛蒙德鏈霉菌添加結(jié)構(gòu)類似物PCA，進(jìn)行推理選育，以期篩選出解除自身次級代謝產(chǎn)物對抗生素合成的自我阻遏。在高質(zhì)量濃度的PCA壓力下，突變株不僅能夠繼續(xù)生長并不受影響，并且產(chǎn)抗生素的能力較野生型有了較大提高。在添加PCA質(zhì)量濃度為100 μg/mL的壓力下，洛蒙真菌素的產(chǎn)量從（33" 1±6" 2）mg/L提高到了（106" 0±4" 4）mg/L。沈劍峰等［25］在卡那霉素鏈霉菌中，通過采用自身代謝產(chǎn)物卡那霉素結(jié)構(gòu)類似物西索米星進(jìn)行抗性篩選，得到了突變菌株，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提升了40％。劉連碧等［26］通過鏈霉素抗性篩選的方法使得天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI1482的抗生素產(chǎn)量（柔紅霉素）提高了1" 5倍。同時在后續(xù)的驗證中，突變株依舊保持高于野生型菌株約3倍的洛蒙真菌素產(chǎn)生量，可見其穩(wěn)定性較好。

在利用抗性篩選方法篩選高產(chǎn)菌株部分，本試驗采用了利福平以及慶大霉素這兩種作用于核糖體附近的抗生素。引入利福霉素以及慶大霉素的抗性突變，洛蒙真菌素的產(chǎn)量均發(fā)生了較為明顯的變化：培養(yǎng)96 h后菌株產(chǎn)量分別達(dá)到了（103" 4±0" 1）mg/L和（81" 2±2" 5）mg/L。Hu等［27］在變鉛青鏈霉菌中利用慶大霉素進(jìn)行抗性篩選，獲得Actionorhodin（Act）和Undecylprodigosin（Red）合成增加的高產(chǎn)抗性株。

此外，從細(xì)胞量的結(jié)果來看，添加高質(zhì)量濃度利福平和慶大霉素后，突變株與野生型菌株相比并沒有太大的變化，可見核糖體工程并不是通過改變細(xì)胞的生長以提高洛蒙真菌素的產(chǎn)量的。HosoyaY等［15］通過對一些ppGpp合成基因（relC）突變的鏈霉菌的分析，發(fā)現(xiàn)依賴ppGpp啟動菌體產(chǎn)抗生素途徑可以被鏈霉素抗性突變所代替。也就是說，核糖體特定位點(diǎn)的突變能夠?qū)е潞颂求w結(jié)構(gòu)的改變，從而使菌株在不含有ppGpp的情況下，最終提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在慶大霉素的篩選中，添加50 mg/mL慶大霉素后洛蒙真菌素的產(chǎn)量反而比添加20 mg/mL慶大霉素低，推測原因可能是不同質(zhì)量濃度的慶大霉素作用在核糖體的位點(diǎn)會有不同。在對天藍(lán)色鏈霉菌（S．coelicolor）和變鉛青鏈霉（S．lividans）這兩種鏈霉菌遺傳學(xué)的模式菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度鏈霉素對S．lividans突變的作用位點(diǎn)是不同的，導(dǎo)致介導(dǎo)抗生素的產(chǎn)生機(jī)制發(fā)生變化，從而使抗生素的最終產(chǎn)量發(fā)生變化［27］。

在后續(xù)的試驗中，可以有針對性的對突變株進(jìn)行遺傳分析，對可能引起突變的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析突變前后的變化，確定其是否帶有核糖體蛋白突變。并將復(fù)合篩選的高產(chǎn)菌株進(jìn)行基因工程改造，以期進(jìn)一步提高洛蒙真菌素的產(chǎn)量。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Induced mutation and selection of Streptomyces lomondensis S015 producing high lomofungin yield

ZHANG Chun-xiao，QIAN Wei，WANG Wei*，HU Hong-bo，PENG Hua-song，ZHANG Xue-hong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

Abstract：A mutant strain S015-P34 was selected from a wild lomofungin-producing Streptomyces lomondensis strain S015 through mutagenesis induced by phenzine-1-catboxylic acid（PCA），and its lomofungin yield reached（106" 0±4" 4）mg/L and 3" 2 times of the wild strain’s；Mutant strains S015-R6 and S015-G11 were selected from the strain S015 through mutagenesis induced by rifampicin and gentamicin antibiotics，and their lomofungin yields were respectively（103" 4±0" 1）mg/L and（81" 2±2" 5）mg/L and respectively 3" 2 times and 2" 5 times of the wild strain’s；The PCA-induced mutagenesis was combined with the rifampicin-induced mutagenesis and a mutant strain S015-R6-46 was obtained，with the lomofungin yield being（168" 0±2" 2）mg/L and 5" 1 times of the wild strain’s" The optimization of S015-R6-46 culture medium showed that the lomofungin yield could reach（258" 7±5" 7）mg/L via addition of 0" 1 mmol/L FeCl3" The above experimental results could be used for reference in induced mutation and selection of streptomycete strains producing high phenazine yields"

Key words：Streptomyces lomondensis；Induced mutation；Screening；Lomofungin；Phenazine compounds

*通信作者：王威（1972—）女，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵與代謝工程。E-mail：weiwang100＠sjtu" edu" cn

作者簡介：張春曉（1989—）女，碩士，研究方向：微生物資源與代謝。E-mail：lnzcx＠sina" cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31270084）；國家973計劃項目（2012CB721005）；國家863計劃項目（2012AA022107）

收稿日期：2015-02-02

文章編號：1000-3924（2016）01-066-06

中圖分類號：S182

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A